Giardia duodenum je parazitický organismus, který způsobuje giardiázu, střevní infekci zvláště častou u malých dětí s klinickými příznaky průjmu.Již dříve jsme uvedli, že extracelulární G. duodenalis spouští aktivaci nukleotidů vázajících intracelulární oligomerizaci podobný receptor 3 (NLRP3) a reguluje zánětlivé reakce hostitele prostřednictvím sekrece extracelulárních vezikul (EV).Přesné molekulární vzorce duodenokokové EV spojené s patogenem (GEV) zapojené do tohoto procesu a role inflammasomu NLRP3 v giardiáze však zbývá objasnit.
Rekombinantní eukaryotické expresní plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardins v GEV byly zkonstruovány, transfekovány do myších primárních peritoneálních makrofágů a detekovány měřením zánětlivé cílové molekuly kaspázy-1.Byla testována hladina exprese p20..G. duodenalis alpha-2 a alpha-7.3 giardines byly původně identifikovány měřením NLRP3 inflammasomu (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-kaspáza-1 a kaspáza-1 p20), sekrece IL.Hladiny 1p, hladiny oligomerizace apoptotického skvrnitého proteinu (ASC) a imunofluorescenční lokalizace NLRP3 a ASC.Role zánětu NLRP3 v patogenitě G. duodenalis byla poté hodnocena pomocí myší, u kterých byla blokována aktivace NLRP3 (myši blokované NLRP3) a byly sledovány patologické změny tělesné hmotnosti, duodenální parazitární zátěž a duodenální tkáň.Kromě toho jsme zkoumali, zda hiardiny alfa-2 a alfa-7.3 indukují sekreci IL-1β in vivo prostřednictvím zánětu NLRP3 a určili jsme roli těchto molekul v patogenitě G. duodenalis u myší.
Alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukují aktivaci NLRP3 inflamasomu in vitro.To vedlo k aktivaci p20 kaspázy-1, zvýšení hladin exprese proteinů NLRP3, pro-IL-1β a pro-kaspázy-1, významnému zvýšení sekrece IL-1β, tvorbě skvrn ASA v cytoplazmě a indukci oligomerizace ASA.Zánět NLRP3 Ztráta penisu zhoršuje patogenitu G. duodenalis u myší.Myši léčené cystami žaludeční sondou od myší blokovaných NLRP3 vykazovaly zvýšený počet trofozoitů a vážné poškození duodenálních klků, charakterizovaných nekrotickými kryptami se scvrklými a větvenými.Experimenty in vivo ukázaly, že giardiny alfa-2 a alfa-7.3 mohou indukovat sekreci IL-lp prostřednictvím zánětu NLRP3 a imunizace giardinami alfa-2 a alfa-7.3 snížila patogenitu G. duodenalis u myší.
Celkově vzato, výsledky této studie naznačují, že Giardia alfa-2 a alfa-7.3 způsobují upregulaci hostitelského zánětu NLRP3 a snižují infekčnost G. duodenalis u myší, což jsou slibné cíle pro prevenci giardiázy.
Giardia duodenum je extracelulární prvokový parazit, který žije v tenkém střevě a způsobuje ročně 280 milionů případů giardiázy s průjmem, zejména u malých dětí v rozvojových zemích [1].Lidé se nakazí pitím vody nebo jídlem kontaminovaným cystami M. duodenum, které se pak dostávají do žaludku a jsou vylučovány žaludečními šťávami.Giardia duodenum trophozoites se přichytí k duodenálnímu epitelu, což způsobuje nevolnost, zvracení, průjem, bolesti břicha a ztrátu hmotnosti.Jedinci s imunodeficiencí a cystickou fibrózou jsou náchylní k infekci.K infekci může dojít také orálním a análním sexem [2].Preferovanými možnostmi léčby duodenálních infekcí jsou léky jako metronidazol, tinidazol a nitazoxanid [3].Tyto chemoterapeutické léky však způsobují nežádoucí vedlejší účinky, jako je nauzea, karcinogeneze a genotoxicita [4].Proto je třeba vyvinout účinnější strategie k prevenci infekce G. duodenalis.
Inflammasomy jsou třídou cytosolových proteinových komplexů, které jsou součástí přirozené imunitní odpovědi, pomáhají bránit invazi patogenů a zprostředkovávat zánětlivé reakce [5].Mezi těmito záněty byl rozsáhle studován zánět nukleotid-vazebný oligomerizační (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotidová vazebná oligomerizace (NLRP3) nukleotidový zánět podobný vazbě, protože jej lze detekovat různými molekulárními vzory spojenými s patogenem/poškozením (PAMP/ DAMP), rozpoznává, aktivuje vrozený imunitní systém.a reguluje střevní homeostázu u mnoha zánětlivých onemocnění [6,7,8].Skládá se z receptoru rozpoznávání vzoru (PRR) NLRP3, adaptorového apoptotického tečkovaného proteinu (ASC) a efektorové prokaspázy-1 nebo prokaspázy-11.Inflammasom NLRP3 působí jako hostitel proti invazi patogenů, jak bylo pozorováno ve studiích Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] a Leishmania.[11], ale také bylo publikováno, že aktivace inflammasomu NLRP3 omezuje ochranné imunitní reakce a zhoršuje progresi onemocnění, například u červů [12].Na základě našich předchozích zjištění jsme uvedli, že extracelulární G. duodenalis spouští intracelulární aktivaci zánětu NLRP3 a moduluje zánětlivé reakce hostitele sekrecí extracelulárních vezikul (EV) [13].Úlohu zánětu NLRP3 v infekci G. duodenalis in vivo však zbývá určit.
Giardini byli původně popsáni jako strukturální složky cytoskeletu G. duodenalis a hrají důležitou roli v pohyblivosti trofozoitů a přichycení epiteliálních buněk v tenkém střevě.Pro lepší adaptaci na prostředí a zvýšení jejich patogenity si G. duodenalis trophozoites vyvinuli unikátní cytoskeletální strukturu skládající se z 8 bičíků, 1 středního těla a 1 ventrálního disku [14].Trofozoiti Giardia duodenum využívají svůj cytoskelet k pronikání do horní části tenkého střeva, zejména do duodena, a připojují se k enterocytům.Neustále migrují a připojují se k epiteliálním buňkám pomocí buněčného metabolismu.Proto existuje úzký vztah mezi jejich cytoskeletem a virulencí.Giardiny specifické pro Giardia duodenum jsou součástí struktury cytoskeletu [15] a dělí se do čtyř tříd: α-, β-, γ- a δ-giardiny.Existuje 21 členů rodiny α-giardinů, z nichž všichni mají schopnost vázat fosfolipidy závislou na vápníku [16].Také spojují cytoskelet s buněčnou membránou.U jedinců s průjmem způsobeným G. duodenalis jsou α-giardiny během infekce vysoce exprimovány a imunoreaktivní [17].Heterologní vakcíny na bázi Giardia alfa-1 chránily u myší proti giardiáze a jsou potenciálními kandidátskými antigeny pro vývoj vakcíny [18].Alfa-8 giardin, lokalizovaný v plazmatické membráně a bičíku, ale ne ve ventrálním disku, zvyšuje motilitu a rychlost růstu trofozoitů u G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin se váže na mikrotubulové struktury na bičíku a ovlivňuje životaschopnost G. duodenalis [20].Alfa-11 giardin je přítomen v hojnosti po celý životní cyklus a nadměrná exprese alpha-11 giardinu poškozuje samotnou G. duodenalis [21].Není však jasné, zda alfa-2 giardin a alpha-7,3 giardin jsou protektivní proti infekci G. duodenalis a jejich základním mechanismům.
V této studii byly rekombinantní eukaryotické expresní plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin transfekovány do myších primárních peritoneálních makrofágů, aby se aktivoval hostitelský NLRP3.Poté byly vyšetřeny zánětlivé cíle.Také jsme hodnotili roli NLRP3 inflamasomu v patogenitě G. duodenalis, zkoumali jsme, zda alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukují aktivaci NLRP3 inflamasomu in vivo, a určili jsme, že tyto dvě role giardinů v patogenitě G. duodenalis.Naším společným cílem bylo vyvinout slibné cíle pro prevenci infekce G. duodenalis.
Samice myší divokého typu (WT) C57BL/6 ve věku 5–8 týdnů byly zakoupeny od Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Čína).Myši měly volný přístup k vodě, dostávaly sterilizované krmivo a byly drženy v cyklu světlo/tma 12/12 hodin.Před infekcí myši dostávaly antibiotika ad libitum v pitné vodě doplněné ampicilinem (1 mg/ml), vankomycinem (1 mg/ml) a neomycinem (1,4 mg/ml) (vše zakoupené v Šanghaji, Čína, umělé organismy) [22 ].].Myši, které ztratily schopnost jíst a pít na > 24 hodin a ztratily ≥ 20 % tělesné hmotnosti, byly humánně usmrceny cervikální dislokací.
Trofozoity WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) byly doplněny 12,5% fetálním bovinním sérem (FBS; Every Green, Zhejiang, Čína) a 0,1% hovězí žlučí (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) za mikroaerobních podmínek.Konfluentní trofozoity byly shromážděny na ledu a pasážovány v poměru 1:4 pro další reprodukci.
Cysty Giardia duodenum byly indukovány, jak bylo popsáno dříve [23], trofozoity byly sklizeny v logaritmické fázi a poté zředěny médiem indukujícím zapouzdření, pH 7,1 (modifikovaný TYI-S-33) na konečnou koncentraci 1 × 106 trofozoitů/ml.koncentrace žluči 0,05 % střední).Trofozoiti se kultivovali za anaerobních podmínek při 37 °C až do fáze logaritmického růstu.Vyměňte médium za médium vyvolávající cysty (pH 7,8; ​​modifikované médium TYI-S-33 s 1% koncentrací žluči) a kultivujte G. duodenalis při 37 °C po dobu 48–96 hodin, během kterých byly pod mikroskopem pozorovány formující se cysty.Poté, co byla u většiny trofozoitů indukována tvorba cyst, byla kultivační směs sklizena a resuspendována ve sterilní deionizované vodě, aby došlo k lýze zbývajících trofozoitů.Cysty byly spočítány a skladovány při 4 °C pro následné analýzy pomocí žaludeční sondy u myší.
Extracelulární vezikuly Giardia (GEV) byly obohaceny, jak bylo popsáno dříve [13].Trophozoiti v logaritmické růstové fázi byli resuspendováni v modifikovaném médiu TYI-S-33 připraveném s FBS ochuzeným o exosomy (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) na konečnou koncentraci 1 x 106 parazitů/ml a inkubovány po dobu 12 hodin.byly izolovány ze supernatantu kultury centrifugací při 2000 g po dobu 10 minut, 10 000 g po dobu 45 minut a 100 000 g po dobu 60 minut.Precipitáty byly rozpuštěny ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), kvantifikovány za použití soupravy pro stanovení proteinů BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a skladovány při -80 °C nebo použity přímo pro další analýzy.
Primární myší peritoneální makrofágy byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve [24].Stručně řečeno, myši (ve věku 6-8 týdnů) byly injikovány (intraperitoneálně [ip]) 2,5 ml 2,98% Difco kapalného thioglykolového média (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) a krmeny 3-4 patra.Suspenze makrofágů byla odebrána z břišní dutiny myší po eutanazii a centrifugována 3krát při 1000 g po dobu 10 minut.Sklizené buňky byly detekovány průtokovou cytometrií s použitím markeru CD11b, dokud čistota buněk nebyla >98 %, poté byly přidány do 6-jamkových destiček pro kultivaci buněk (4,5 x 106 buněk/jamku) a inkubovány s 10% FBS (Bioindustry) při 37 °C.a 5 % CO2.
RNA byla extrahována z 1 × 107 trofozoitů v 1 ml činidla TRIzol (Vazyme, Nanjing, Čína), genomová DNA byla extrahována z celkové RNA G. duodenalis pomocí MonScript dsDNázy (Monad, Wuhan, Čína) a byla syntetizována komplementární DNA (cDNA) pomocí MonScript RTIIII Super Mix (Monad) podle pokynů výrobce.
Informace o sekvenci CDS pro cílový gen G. duodenalis byly získány z NCBI GenBank.Použijte Primer 5.0 k navržení specifických bezproblémových klonovacích primerů pro každý cílový gen.Dopředný primer (5′-3′) se skládá ze tří částí: překrývající se sekvence s linearizovaným vektorem pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) a start kodony ATG a GNN (pokud první báze není G).To se provádí pro zlepšení účinnosti výrazu.Navíc alespoň 16 bp kombinované báze (obsah GC 40–60 %/Tm cca 55 °C).Reverzní primer (5'-3') se skládá ze dvou částí, překrývající se sekvence s EcoRV-linearizovaným vektorem pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) a kombinované báze alespoň 16 bp.(kromě posledních dvou zastávek).báze) kodon, jako je AA nebo GA, který umožňuje rekombinantním plasmidům exprimovat jejich značené proteiny).Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1 a byly syntetizovány společností Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Čína).
Cíle byly amplifikovány pomocí Pfu DNA polymerázy (Tiangen, Peking, Čína) nebo Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Čína) za použití připravené cDNA G. duodenalis jako templátu.Plazmid eukaryotického expresního vektoru pcDNA3.1(+) byl linearizován restrikčním enzymem EcoRV a defosforylován pomocí Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizované fragmenty pcDNA3.1(+) a amplifikované fragmenty cílového genu byly purifikovány pomocí DNA gel purification kit (Tiangen) a kvantifikovány pomocí Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) a každý fragment cílového genu byly rekombinovány za použití klonovací směsi MonClone s jedním sestavením (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Čína) a potvrzeny sekvenováním DNA pomocí Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Čína)..
Plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 bez endotoxinu byly vytvořeny pomocí sady SanPrep Plasmid Mini Kit bez endotoxinu (Sangon Biotech).Koncentrace byla udržována nad 500 ng/ul, aby se zajistilo, že EDTA v elučním pufru neinterferuje s transfekčním testem.Primární myší peritoneální makrofágy byly kultivovány v 6-jamkových destičkách s kompletním médiem RPMI 1640 (Biological Industries) po dobu 12 hodin, poté byly buňky 3krát promyty v teplém PBS, aby se odstranil penicilin a streptomycin, a poté v médiu doplněném kompletním médiem.Plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 ug) bez endotoxinu byly zředěny ve 125 ul média s redukovaným sérem Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Poté bylo 5 ul transfekčního činidla Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) zředěno ve 125 ul média Opti-MEM s nízkým obsahem séra.Připravte komplexy liposom-DNA smícháním zředěného plasmidu bez endotoxinu s Lipofectamine 2000 a ponecháním směsi stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut.Přeneste komplexy odděleně do buněk v každé jamce a pomalu promíchejte.Po 4 hodinách bylo médium buněčné kultury nahrazeno 2 ml kompletního média RPMI 1640 a kultivace pokračovala po dobu 24 hodin.K buňkám bylo přidáno čerstvé buněčné kultivační médium a inkubováno po různé časové body v závislosti na designu testu.
Vzorky proteinů ze supernatantů a buněčných lyzátů byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve [25].Parametry membránového přenosu pro pro-IL-lp, pro-kaspázu-1, kaspázu-1 p20, NLRP3, p-aktin a His-tag byly 200 mA/90 min.Pro interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspázu-1 (p20) (Adipogen, Švýcarsko) a NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Švýcarsko) a 1:5000 zacílené na His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Čína) a β-aktin (Proteintech, Wuhan, Čína).
Síťování s disukcinimid suberátem (DSS) bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [26].Buňky byly 3krát promyty studeným PBS a kompletně lyžovány jehlou 27 gauge v 50 ul reakčního pufru ASC (pH 8,0) obsahujícího 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES a 125 mM NaHC03.Směs byla centrifugována při 5000 g po dobu 3 minut a peleta byla sešita 10 ul DSS (25 mM v DMSO) a 40 ul ASC reakčního pufru po dobu 30 minut při 37 °C.Po centrifugaci při 5000 g po dobu 10 minut byla peleta rozpuštěna v roztoku 40 ul reakčního pufru ASC a 10 ul 6x pufru pro nanášení proteinu (TransGen, Beijing, Čína) a poté byl roztok zchlazený při teplotě místnosti po dobu 15 min., Poté vařte 10 minut.Vzorky proteinů byly poté podrobeny Western blotu s použitím primárních anti-ASC protilátek (Wanleibio, Shenyang, Čína) v poměru ředění 1:500.
Podle dříve popsaného postupu [13] byly supernatanty buněčných kultur sklizeny a sekrece prozánětlivého cytokinu IL-1β byla stanovena pomocí soupravy myší IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Převeďte hodnoty OD450nm na koncentrace proteinů pomocí standardní křivky IL-1β.
Buňky potažené krycími sklíčky byly jemně promyty 3krát v teplém PBS, fixovány ve fixativu tkáňových buněk (Biosharp, Peking, Čína) po dobu 10 minut při teplotě místnosti (RT), v 0,1% Triton X-Permeabilize při 100 (naředěno v PBS; Biosharp ) po dobu 20 minut při teplotě místnosti a blokovat v 5% hovězím sérovém albuminu (v PBS) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.Buňky byly poté inkubovány přes noc při 4 °C s primárními protilátkami proti ASC (ředění 1:100) nebo NLRP3 (ředění 1:100), v daném pořadí, a Cy3 značeným kozím anti-králičím IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) nebo FITC-konjugovaný kozí anti-myší IgG (1:400; Earthox) přes noc při 37 °C ve tmě po dobu 1 hodiny.Jádra byla obarvena Hoechst 33258 (10 ug/ml; UE, Suzhou, Čína) po dobu 5 minut a pozorována pod fluorescenčním mikroskopem (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko).
Myši byly rozděleny do čtyř skupin (n = 7 v každé skupině): (i) negativní kontrolní skupina ošetřená PBS (pouze PBS; žaludeční sondou 100 ul/myš PBS s následnou denní intraperitoneální injekcí 100 ul/myš PBS o 3 hodiny později)., nepřetržitě po dobu 7 dnů);(ii) negativní kontrolní skupina léčená inhibitorem MCC950 [27] (100 ul/myš pomocí sondy PBS, o 3 hodiny později, 10 mg/kg tělesné hmotnosti [BW] MCC950 [v PBS] bylo podáváno intraperitoneálně denně, trvání 7 dní);(iii) skupina infekce cysty G. duodenalis (1,5 x 106 cyst/myš sondou, o 3 hodiny později, 100 ul/myš PBS intraperitoneálně podávané denně po dobu 7 dnů);(iv) Skupina s kombinovanou infekcí cysty G. duodenalis Skupina léčená inhibitorem MCC950 (1,5 x 106 cyst/myš pomocí žaludeční sondy, 10 mg/kg tělesné hmotnosti MCC950 intraperitoneálně denně po dobu 7 dnů po 3 hodinách).Tělesná hmotnost každé myši byla sledována denně a všechny myši byly usmrceny 7. den.Sklizený duodenum (3 cm dlouhý) byl nakrájen na malé kousky v 1 ml PBS, cysty byly zničeny přes noc v PBS při 4 °C a G. duodenalis trophozoites.Čerstvý duodenum (1 cm dlouhý) byl izolován pro barvení hematoxylinem a eosinem (H&E).
Myši byly rozděleny do dvou skupin: (i) kontrolní skupina MOCK a (ii) skupina inhibitoru MCC950.V každé skupině bylo pět ošetření (n = 7/ošetřovaná skupina): (i) negativní kontrolní skupina ošetření PBS (pouze PBS; 100 µl/myš PBS, intramuskulární (IM) injekce (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plasmidová negativní kontrolní skupina (100 ug/myš DNA, intramuskulární injekcí) (iii) pozitivní kontrolní skupina s infekcí cyst G. duodenalis (1,5 x 106 cyst/myš, pomocí žaludeční sondy); skupina ošetřená plazmidem pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 ug/myš DNA, intramuskulární injekcí) a (v) skupina ošetřená plazmidem pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 ug/myš DNA, po 12 hodinách pasáže, myši ve skupině s inhibitorem MCC950 dostávaly denně intraperitoneální injekci MCC950 (10 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 7 dnů, zatímco myši ve skupině MOCK dostávaly stejný objem léčby PBS. Vzorky krve byly odebrané z myší oční bulvy a ponechány přes noc při 4 °C Vzorky séra byly izolovány pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA) a měření hladin IL-lp.
Třicet pět myší bylo rozděleno do pěti skupin (n=7/skupina).Skupina 1 byla negativní kontrolní skupina léčená PBS: myši dostaly 100 ul PBS intramuskulárně a o 3 dny později žaludeční sondou.Skupina 2 je pozitivní kontrolní skupina infikovaná cystami G. duodenalis: myším bylo injikováno 100 ul PBS a o 3 dny později bylo intragastricky injikováno 1,5 x 106 cyst/myš.Třetí skupina – imunizace plazmidem pcDNA3.1(+) v kombinaci s kontrolní skupinou pro infekci duodenální cystou: myši dostávaly 100 μg plazmidové DNA pcDNA3.1(+)(im) perorálně, 1,5×106 cyst/myš 3 po několik dní.Skupiny 4 a 5 byly rekombinantní pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinový plazmid nebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinový plazmid v kombinaci s infekcí cyst G. duodenalis.Experimentální skupina: myši dostaly 100 ug pcDNA3.1(+)-giardinová plazmidová DNA (im), poté o 3 dny později bylo žaludeční sondou injikováno 1,5 x 106 cyst/myš.Tělesná hmotnost každé myši byla sledována po zavedení cysty G. duodenalis trubicí.Čerstvé duodenum bylo odebráno pro měření parazitární zátěže a analýzu barvení HE.
Histopatologické změny byly analyzovány podle dříve publikovaného postupu [30].Čerstvý duodenum byl fixován fixačním prostředkem pro tkáňové buňky, zalitý do parafínu, nařezán na 4 μm řezy, obarven H&E a analyzován pod světelným mikroskopem.Reprezentativní patologické změny v sedmi tkáňových řezech od sedmi nezávislých myší byly hodnoceny patologem, který si nebyl vědom léčby, a byly zachyceny při 200násobném zvětšení.Délka klků a hloubka krypt byly měřeny v souladu s dříve popsanými metodami.
Výsledky in vitro a in vivo byly získány v triplikátech.Grafy byly generovány pomocí GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Rozdíly mezi dvěma skupinami byly analyzovány t-testem, zatímco rozdíly mezi ≥3 skupinami byly analyzovány jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softwaru SPSS (verze 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data byla analyzována na homogenitu rozptylu pomocí Leveneova testu následovaného Bonferroniho post hoc testem (B).Významnost je vyjádřena jako P<0,05, P<0,01 a P<0,001 (nevýznamné [ns]) (P>0,05).
Naše předchozí analýza proteomiky GEV v Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ukázala, že na aktivaci zánětlivých signálních drah se může podílet mnoho cílů [13].Vybrali jsme dva slibné cíle, alpha-2 a alpha-7.3 giardiny, amplifikovali jsme tyto molekuly a použili je ke konstrukci eukaryotického expresního vektoru pcDNA3.1(+).Po sekvenování byly rekombinantní plasmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alpha-7.3 giardine transfekovány do primárních myších peritoneálních makrofágů a byl identifikován zánětlivý protein kaspázy-1 p20 (fragment aktivované kaspázy-1). jako objasnění klíčových molekul, které mohou vyvolat zánět.Výsledky ukázaly, že alfa-2 a alfa-7,3 giardiny mohou indukovat expresi p20 kaspázy-1 podobnou GEV.Žádný účinek na aktivaci kaspázy-1 nebyl zjištěn u neošetřené negativní kontroly (pouze PBS) a plasmidové kontroly pcDNA3.1(+) (obrázek 1).
Měření aktivace kaspázy-1 p20 pomocí pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardinů.Rekombinantní eukaryotické expresní plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardiny (nad každou dráhou) byly transfekovány do primárních myších peritoneálních makrofágů a supernatanty kultury byly sklizeny o 24 hodin později.Western blotování bylo použito k měření hladin exprese charakteristické kaspázy-1 p20 zánětlivého proteinu.Léčebná skupina pouze s PBS (dráha C) a skupina s monoterapií pcDNA3.1(+) (dráha pcDNA3.1) byly použity jako negativní kontrola a skupina ošetřovaná GEV byla použita jako pozitivní kontrola.Exprese rekombinantního proteinu byla potvrzena detekcí histidinové značky v každém proteinu a očekávané proteinové pásy byly alfa-2 giardin (38,2 kDa) a alfa-7,3 giardin (37,2 kDa).GEV, extracelulární vezikuly Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizovaný vektor, SUP, supernatant
Pro určení, zda alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin indukují expresi p20 kaspázy-1 a hrají roli při aktivaci zánětlivé reakce hostitele NLRP3, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardin byl transfekován do primárních myších peritoneálních makrofágů rekombinantní plasmidovou DNA a byly stanoveny hladiny exprese, lokalizace a oligomerizace klíčových zánětlivých proteinů NLRP3.V tomto experimentu byla GEV použita jako pozitivní kontrolní skupina a skupina bez ošetření (pouze PBS) nebo skupina s transfekcí pcDNA3.1(+) byla negativní skupinou.Výsledky ukázaly, že stejně jako ve skupině GEV vedla rekombinantní plazmidová DNA giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 a giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 k upregulaci NLRP3, pro-IL-lp a aktivace prokaspázy-1 a kaspázy-1 (obr. 2a).Kromě toho oba giardiny indukovaly významnou sekreci IL-lp (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (obrázek 2b).Většina ASC proteinů byla monomerní ve skupině bez léčby nebo v léčené skupině transfekované plazmidem pcDNA3.1(+), na rozdíl od pcDNA3.1(+)-alfa-2 nebo pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardina.ASC oligomerizace se objevila v rekombinantní plazmidové DNA GEV pozitivní kontrolní skupiny nebo skupiny, vykazující oligomerní formu (obrázek 2c).Tyto předběžné údaje naznačují, že alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin mohou indukovat aktivaci zánětu NLRP3.Následné imunofluorescenční studie lokalizace ASC a NLRP3 ukázaly, že v negativní kontrolní skupině byl protein ASC rozptýlen v cytoplazmě a objevil se jako bodový signál po stimulaci pcDNA3.1(+)-alfa-2 pomocí giardinu nebo pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardinová skupina nebo GEV pozitivní kontrolní skupina (obrázek 2d).Ve skupinách s negativní kontrolou a plasmidem ošetřeným pcDNA 3.1 nebyl signál proteinu NLRP3 detekován, zatímco fluorescenční signální bod v reakci na pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin nebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 bylo zjištěno..giardin se nacházejí v cytoplazmě nebo po stimulaci HEV (obr. 2e).Tato data dále ukazují, že G. duodenalis giardin alpha-2 a giardin alpha-7.3 aktivují NLRP3 inflammasom v myších primárních peritoneálních makrofázích.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktivují NLRP3 inflammasom v myších peritoneálních makrofázích.Transfektujte rekombinantní eukaryotické expresní plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin do primárních myších peritoneálních makrofágů a buněk nebo sklidte supernatant do 24 hodin pro analýzu exprese, oligomerizaci , sekrece.a lokalizace klíčových zánětlivých proteinů.Skupina pouze s PBS (C) a skupina s jedinou léčbou pcDNA3.1(+) byly použity jako negativní kontrola a skupina léčená GEV byla použita jako pozitivní skupina.a Klíčové zánětlivé proteiny NLRP3, včetně NLRP3, pro-IL-lp, pro-kaspázy-1 a p20 kaspázy-1, byly detekovány metodou Western blotting.b Hladiny sekrece IL-lp v supernatantech byly stanoveny pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA).Rozdíly mezi kontrolními a experimentálními skupinami byly analyzovány jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA) za použití softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly mezi skupinami **P<0,01 a ***P<0,001.c Úrovně oligomerizace ASC v peletách byly stanoveny pomocí DSS síťovací analýzy, zatímco hladiny ASC v buněčných lyzátech byly použity jako kontrola nanášení.d Vizualizace lokalizace ISC pomocí imunofluorescence.e Imunofluorescence byla použita k vizualizaci lokalizace NLRP3.ASC, apoptotický speck-like protein;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid-vazebný oligomerizační receptor 3;ns, nevýznamné (P > 0,05)
Jak G. duodenalis, tak GEV, které vylučuje, aktivují inflammasom NLRP3 a regulují zánětlivé reakce hostitele in vitro.Role inflammasomu NLRP3 v patogenitě G. duodenalis tedy zůstává nejasná.Abychom prozkoumali tento problém, navrhli jsme experiment mezi myšmi infikovanými cystou G. duodenalis a myšmi infikovanými cystou G. duodenalis + léčba inhibitorem MCC950 a porovnali jsme expresi zánětu NLRP3 při infekci cystou G. duodenalis.Detailní schéma experimentu je na obr. 3a.Změny tělesné hmotnosti myší v různých léčebných skupinách byly monitorovány po dobu 7 dnů po infekci cystami a výsledky jsou uvedeny na obr. 3b.Ve srovnání se skupinou léčenou čistým PBS výsledky ukázaly, že (i) tělesná hmotnost myší infikovaných cystou G. duodenalis se snížila ze dne 3 na den 7 po infekci;(ii) léčba inhibitorem MCC950 neměla žádný významný účinek na tělesnou hmotnost myší..Ve srovnání se skupinou s jednou infekcí se BW skupiny s duodenální infekcí léčenou MCC950 v různé míře snížila (1. den: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. den: ANOVA, F( 3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001 Den 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Den 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Den 6: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; Den 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Tato data prokazují, že inflammasom NLRP3 chrání myši před významným úbytkem hmotnosti v časných stádiích (2-4 dny) infekce dvanácterníku.Poté jsme se zaměřili na detekci trofozoitů G. duodenalis v duodenální lavážní tekutině a výsledky jsou uvedeny na obrázku 3c.Ve srovnání se skupinou s infekcí cysty G. duodenalis se počet trofozoitů v duodenu významně zvýšil po zablokování inflammasomu NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenální tkáně obarvené HE ukázaly ve srovnání s negativní kontrolou ošetřenou samotným PBS a MCC950: (i) infekce cysty G. duodenalis vedla k poškození duodenálních klků (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) a atrofie krypt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum z myší infikovaných cystami G. duodenalis a léčených inhibitory MCC950.duodenální klky byly poškozené a mrtvé (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) s atrofií a větvením krypt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (obr. 3d- f) .Tyto výsledky naznačují, že inflammasom NLRP3 hraje roli při snižování patogenity G. duodenalis.
Role inflamasomu NLRP3 při infekci Giardia duodenum.Myším byly podány žaludeční sondou (iv) duodenokokové cysty a poté byly ošetřeny s nebo bez MCC950 (ip).Jednotlivé léčebné skupiny s PBS nebo MCC950 byly použity jako kontroly.Experimentální skupina a léčebný režim.b Tělesná hmotnost myší v každé z různých léčebných skupin byla monitorována po dobu 7 dnů.Rozdíl mezi skupinou s infekcí G. duodenalis a skupinou léčenou infekcí G. duodenalis + MCC950 byl analyzován t-testem za použití softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly při *P<0,05, **P<0,01 nebo ***P<0,001.c Parazitická zátěž byla stanovena spočítáním počtu trofozoitů v duodenální lavážní tekutině.Rozdíl mezi skupinou s infekcí G. duodenalis a skupinou léčenou infekcí G. duodenalis + MCC950 byl analyzován t-testem za použití softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly při *P < 0,05.d Výsledky barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) duodenální histopatologie.Červené šipky označují poškození klků, zelené šipky označují poškození krypt.Měřítko: 100 µm.e, f Statistická analýza výšky duodenálních klků a výšky myší krypty.Hvězdičky označují významné rozdíly při *P<0,05 a **P<0,01.Výsledky jsou převzaty ze 7 nezávislých biologických experimentů.BW, tělesná hmotnost;ig, intragastrický způsob dodání;ip, intraperitoneální způsob podávání;ns, nevýznamné (P > 0,05);PBS, fyziologický roztok pufrovaný fosfátem;WT, divoký typ
Sekrece IL-lp je charakteristickým znakem aktivace zánětu.Abychom určili, zda G. duodenalis alfa-2 giardin a alpha-7,3 giardine aktivují NLRP3 hostitelský inflamasom in vivo, použili jsme neléčené WT myši (falešná skupina) a NLRP3 inflammasom-blokované myši (MCC950 inhibovaná léčebná skupina).Detailní schéma experimentu je na obr. 4a.Experimentální skupiny sestávaly z myší ošetřených PBS, ošetření cyst G. duodenalis sondou, intramuskulární injekcí pcDNA3.1 a intramuskulární injekcí pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinu nebo pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinu.Sedmý den po intramuskulárním podání rekombinantního plazmidu bylo odebráno sérum a byla stanovena hladina IL-lp v každé skupině.Jak je znázorněno na obrázku 4b, ve skupině MOCK: (i) ve srovnání se skupinou PBS neměla léčba pcDNA3.1 žádný významný účinek na sekreci IL-lp (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), nicméně Sekrece IL-β byla významně zvýšená ve skupině cyst G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin a pcDNA3.1- Intramuskulární injekce alfa-7,3 giardinu významně zvýšila hladiny IL-lp v séru (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin indukoval vysoké hladiny sekrece IL-1p ve skupině s intramuskulární injekcí pcDNA3.1-alfa-2 giardin (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Ve srovnání s každou skupinou v léčebné skupině MCC950 a skupině MOCK: (i) hladiny sekrece IL-1β v kontrolní skupině PBS a kontrolní skupině pcDNA3.1 se po blokování inhibitoru MCC950 do určité míry snížily, ale rozdíl nebyl signifikantní (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) po zablokování MCC950.sekrece IL-1β byla významně snížena ve skupině infikované cystou G. duodenalis, ve skupině pcDNA3.1-alpha-2 giardine a skupině pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9) ,58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; ) = 3,540, P = 0,0164).Tyto výsledky naznačují, že alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin zprostředkovávají aktivaci NLRP3 inflamasomu in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiny aktivují in vivo hostitelský inflamasom NLRP3.Myši byly imunizovány (IM) rekombinantním eukaryotickým expresním plazmidem pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinem nebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinem a poté ošetřeny MCC950 (ip; skupina MCC950) nebo nikoli (fiktivní skupina ).Skupina ošetřená PBS nebo plasmidem pcDNA3.1(+) byla použita jako negativní kontrola, skupina ošetřená cystou G. duodenalis byla použita jako pozitivní kontrola.Experimentální skupina a léčebný režim.b Sérové ​​hladiny IL-lp u myší byly měřeny v den 7 testem ELISA.Rozdíly mezi skupinami ve skupině MOCK byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA a rozdíly mezi skupinou MOCK a skupinou MCC950 byly analyzovány pomocí t-testu softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly mezi léčebnými skupinami ve skupině MOCK, *P<0,05 a ***P<0,001;znaky dolaru ($) indikují významné rozdíly mezi každou skupinou ve skupině MOCK a skupinou MCC950 při P<0,05.Výsledky sedmi nezávislých biologických experimentů.i, intramuskulární injekce, ns, nevýznamné (P > 0,05)
Abychom prozkoumali účinek aktivace hostitelského zánětu NLRP3 zprostředkované alfa-2 a alfa-7,3 giardinem na infekčnost G. duodenalis, použili jsme myši WT C57BL/6 a injikovali jsme alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin.plasmid byl intramuskulárně injikován po 3 dnech žaludeční sondou cysty G. duodenalis, načež byly myši pozorovány po dobu 7 dnů.Detailní schéma experimentu je na obr. 5a.Tělesná hmotnost každé myši byla měřena každý den, vzorky čerstvé duodenální tkáně byly odebrány 7. den po podání žaludeční sondou, byl měřen počet trofozoitů a byly pozorovány histopatologické změny.Jak je znázorněno na obrázku 5b, s rostoucí dobou krmení se tělesná hmotnost myší v každé skupině postupně zvyšovala.MT u myší začala klesat 3. den po intragastrickém podání cyst G. duodenalis a poté se postupně zvyšovala.Aktivace zánětu NLRP3 indukovaná intramuskulární injekcí alfa-2 giardinu a alpha7.3 giardinu významně zmírnila úbytek hmotnosti u myší (1. den: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Den 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Den 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Den 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Den 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Den 4: pcDNA3.1-alfa-2 , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Den 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Den 5: pcDNA3.1-alpha 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Den 5: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Den 6: -1 ks alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, den 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Den 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Den 7: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazitární zátěž byla hodnocena v duodenu (obr. 5c).Ve srovnání s neošetřenou pozitivní kontrolou a skupinou, které byl injikován prázdný vektor pcDNA3.1, byl počet trofozoitů G. duodenalis významně snížen ve skupinách, kterým byl injikován α-2 giardin a α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alpha -2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Kromě toho giardin alfa-7,3 měl větší ochranu u myší než giardin alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Výsledky barvení HE jsou uvedeny na Obr.5d-f.Myši injikované alfa-2 giardinem a alfa-7,3 giardinem měly méně lézí duodenální tkáně, projevujících se poškozením klků, ve srovnání s myšmi, kterým byl injikován G. duodenalis a myší, kterým byl injikován G. duodenalis v kombinaci s prázdným vektorem pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 nebo P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 nebo P = 0,0055) a snížená atrofie krypt (pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 nebo P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA F(3,24) = 1,470, P = 0,0371 nebo P = 0,0191).Tyto výsledky naznačují, že alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin snižují infekčnost G. duodenalis aktivací NLRP3 inflammasomu in vivo.
Role pcDNA3.1(+)-giardinů v infekci G. duodenalis.Myši byly imunizovány (IM) rekombinantními eukaryotickými expresními plasmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin nebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin a poté stimulovány cystami G. duodenalis (ig).Skupina PBS a skupina léčená pcDNA3.1(+) + duodenální cystou byly použity jako negativní kontrolní skupiny a skupina léčená duodenální cystou byla použita jako pozitivní kontrolní skupina.Experimentální skupina a léčebný režim.b MT myší v každé z různých léčebných skupin byla monitorována po dobu 7 dnů po provokaci.Hvězdičky označují významné rozdíly mezi skupinami ve skupině G. duodenalis a skupinou pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin, *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001;znak dolaru ($) označuje významný rozdíl mezi každou skupinou G. duodenalis a skupinou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine, $$P<0,01 a $$$P<0,001.c Parazitická zátěž byla stanovena spočtením počtu trofozoitů v 1 ml duodenální laváže z duodena (3 cm dlouhé) a vyjádřena jako počet parazitů na cm duodena.Rozdíly mezi infekční skupinou G. duodenalis, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinovou skupinou a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinovou skupinou byly analyzovány jednocestnou ANOVA s použitím softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly při **P<0,01 a ***P<0,001.d Histopatologické změny v duodenu.Červené šipky označují poškození klků, zelené šipky označují poškození krypt.Měřítko: 100 µm.e, f Statistická analýza výšky myších duodenálních klků (e) a výšky krypty (f).Rozdíly mezi skupinami na obrázku 1d byly analyzovány jednocestnou ANOVA s použitím softwaru SPSS verze 22.0.Hvězdičky označují významné rozdíly při *P<0,05 a **P<0,01.Výsledky sedmi nezávislých biologických experimentů.ns, nevýznamné (P > 0,05)
Giardia duodenum je známý střevní parazit lidí a jiných savců, který způsobuje giardiázu.V roce 2004 byla zařazena do iniciativy WHO pro zanedbané nemoci kvůli své vysoké prevalenci během 6 let, zejména v komunitách s nízkým socioekonomickým statusem [32].Vrozený imunitní systém hraje kritickou roli v imunitní odpovědi na infekci G. duodenalis.Bylo popsáno, že myší makrofágy pohlcují a zabíjejí G. duodenalis uvolněním extracelulárních pastí [33].Naše předchozí studie ukázaly, že G. duodenalis, neinvazivní extracelulární parazit, aktivuje zánětlivé signální dráhy p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 a NLRP3 v myších makrofázích, aby reguloval zánětlivé reakce hostitele, a uvolněný GEV může tento proces posílit.13], 24].Přesné PAMP zapojené do zánětu regulovaného zánětem NLRP3 v GEV a úloha zánětu NLRP3 v giardiáze však zbývá objasnit.Abychom osvětlili tyto dvě otázky, provedli jsme tuto studii.
Inflammasom NLRP3 se nachází v cytoplazmě imunitních buněk a může být aktivován různými částicemi, jako jsou krystaly kyseliny močové, toxiny, bakterie, viry a paraziti.V bakteriálních studiích byly toxiny identifikovány jako klíčové PAMP, které aktivují zánětlivé senzory, což vede k zánětu a buněčné smrti [34].Některé strukturně odlišné toxiny, jako je hemolysin ze Staphylococcus aureus [35] a Escherichia coli [36], hemolyzin BL (HBL) z enterotoxinu (NHE) [37], indukují aktivaci zánětu NLRP3.Virové studie ukázaly, že virulentní proteiny, jako je obalový protein (E) SARS-COV-2 [38] a protein NS5 viru Zika [39], jsou důležité PAMP rozpoznávané receptorem NLRP3.Ve studiích parazitů bylo hlášeno, že mnoho parazitů je spojeno s aktivací zánětu hostitele, jako je Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] a Leishmania [42].Husté granulované proteiny GRA35, GRA42 a GRA43, spojené s virulencí Toxoplasma gondii, jsou nutné pro indukci pyroptózy u makrofágů potkanů ​​Lewis [43].Některé studie Leishmania se navíc zaměřily na jednotlivé molekuly podílející se na zánětu NLRP3, jako je lipofosfoglykan parazitní membrány [44] nebo metaloproteáza zinku [45].V rámci rodiny genů alfa-giardin podobných annexinu se alpha-1 giardin ukázal jako potenciální kandidát na vakcínu poskytující ochranu proti G. duodenalis na myším modelu [18].V naší studii jsme vybrali faktory virulence G. duodenalis alpha-2 a alpha-7,3 giardines, které jsou jedinečné pro giardia, ale relativně méně uváděné.Tyto dva cílové geny byly klonovány do vektoru eukaryotického expresního systému pcDNA3.1(+) pro analýzu aktivace zánětu.
V našem myším modelu slouží štěpené fragmenty kaspázy jako markery zánětlivé aktivace.Po stimulaci NLRP3 interaguje s ASC, rekrutuje prokaspázy a generuje aktivní kaspázy, které štěpí pro-IL-lp a pro-IL-18 na zralý IL-lp a IL-18, v tomto pořadí -18.Zánětlivé kaspázy (kaspázy-1, -4, -5 a -11) jsou konzervovanou rodinou cysteinových proteáz, které jsou kritické pro vrozenou obranu a podílejí se na zánětu a programované buněčné smrti [46].Kaspáza-1 je aktivována kanonickými záněty [47], zatímco kaspázy-4, -5 a -11 jsou štěpeny při tvorbě atypických zánětů [48].V této studii jsme použili myší peritoneální makrofágy jako model a zkoumali jsme kaspázu-1 štěpenou p20 kaspázou-1 jako marker aktivace zánětu hostitele NLRP3 ve studiích infekce G. duodenalis.Výsledky ukázaly, že mnoho alfa-giardinů je odpovědných za typickou aktivaci zánětu, což je v souladu s objevem klíčových virulentních molekul zapojených do bakterií a virů.Naše studie je však pouze předběžným screeningem a existují další molekuly, které mohou aktivovat neklasické záněty, protože naše předchozí studie nalezla klasické i neklasické záněty u infekce G. duodenalis [13].Abychom dále určili, zda je generovaná p20 kaspáza-1 spojena s zánětem NLRP3, transfekovali jsme alfa-2 a alfa-7,3 giardiny do myších peritoneálních makrofágů, abychom určili úrovně exprese proteinů klíčových molekul a úrovně oligomerizace ASC, což potvrdilo, že se aktivují oba a-giardiny. inflammasom NLRP3.Naše výsledky se mírně liší od výsledků Manko-Prykhody et al., kteří uvedli, že stimulace buněk Caco-2 samotnými kmeny G. muris nebo E. coli EPEC může zvýšit intenzitu fluorescence NLRP3, ASC a kaspázy-1, i když ne významně, zatímco kostimulace G. muris a E. coli zvýšila hladiny tří proteinů [49].Tato nesrovnalost může být způsobena rozdíly ve výběru druhů Giardia, buněčných linií a primárních buněk.Provedli jsme také in vivo testy s použitím MCC950 u 5 týdnů starých samic myší WT C57BL/6, které jsou náchylnější k G. duodenalis.MCC950 je silný a selektivní inhibitor NLRP3 s malou molekulou, který blokuje kanonickou a nekanonickou aktivaci NLRP3 v nanomolárních koncentracích.MCC950 inhibuje aktivaci NLRP3, ale neovlivňuje aktivaci zánětlivých drah AIM2, NLRC4 a NLRP1 nebo signálních drah TLR [27].MCC950 blokuje aktivaci NLRP3, ale neinhibuje iniciaci NLRP3, eflux K+, influx Ca2+ nebo interakci mezi NLRP3 a ASC;místo toho inhibuje aktivaci zánětu NLRP3 blokováním oligomerizace ASC [27].Proto jsme použili MCC950 ve studii in vivo k určení role zánětu NLRP3 po injekci giardinu.Aktivovaná kaspáza-1 p10 štěpí prozánětlivé cytokiny pro-IL-1β a pro-IL-18 na zralý IL-1β a IL-18 [50].V této studii byly hladiny IL-lp v séru u myší léčených giardinem s nebo bez MCC950 použity jako indikátor toho, zda byl aktivován zánět NLRP3.Jak se očekávalo, léčba MCC950 významně snížila hladiny IL-lp v séru.Tato data jasně prokazují, že G. duodenalis giardin alfa-2 a giardin alfa-7.3 jsou schopny aktivovat myší zánět NLRP3.
Významná data nashromážděná za poslední desetiletí prokázala, že IL-17A je hlavním regulátorem imunity proti G. muris, indukuje signalizaci IL-17RA, produkuje antimikrobiální peptidy a reguluje aktivaci komplementu [51].Infekce Giardia se však vyskytuje častěji u mladých dospělých a bylo hlášeno, že infekce Giardia u mladých myší neaktivuje odpověď IL-17A, aby uplatnila svůj ochranný účinek [52], což vede výzkumníky k hledání jiných imunomodulačních Giardií.mechanismy helmintové infekce.Autoři nedávné studie uvedli, že G. muris může aktivovat zánět NLRP3 prostřednictvím E. coli EPEC, který podporuje produkci antimikrobiálních peptidů a snižuje jeho vazebnou kapacitu a počet trofozoitů ve střevním traktu, čímž snižuje závažnost tlustého střeva onemocnění způsobená bacily [49••].Inflammasom NLRP3 se podílí na vzniku různých onemocnění.Studie ukázaly, že Pseudomonas aeruginosa spouští autofagii v makrofázích, aby se zabránilo buněčné smrti, a tento proces závisí na aktivaci zánětu NLRP3 [53].U N. caninum omezuje aktivace inflammasomu NLRP3 zprostředkovaná reaktivními druhy kyslíku jeho replikaci v hostiteli, což z něj činí potenciální terapeutický cíl [9].Bylo zjištěno, že Paracoccidioides brasiliensis indukuje aktivaci inflammasomu NLRP3 v dendritických buňkách odvozených z myší kostní dřeně, což vede k uvolnění zánětlivého cytokinu IL-1β, který hraje kritickou roli v obraně hostitele [10].Několik druhů Leishmania, včetně L. amazonensis, L. major, L. braziliensis a L. infantum chagasi, aktivuje NLRP3 a ASC-dependentní kaspázu-1 v makrofázích, stejně jako infekci Leishmania.Replikace parazitů je zvýšena u myší s deficitem genu NLRP3/ASC/kaspáza-1 [11].Zamboni a kol.Bylo hlášeno, že infekce Leishmania indukuje aktivaci zánětu NLRP3 v makrofázích, což omezuje intracelulární replikaci parazitů.Leishmania tedy může inhibovat aktivaci NLRP3 jako strategii vyhýbání se.Ve studiích in vivo přispěl zánět NLRP3 k eliminaci leishmanie, ale neovlivnil tkáně [54].Naopak ve studiích helmintiázy aktivace inflammasomu NLRP3 potlačila protektivní imunitu hostitele proti gastrointestinální helmintiáze [12].Shigella je jednou z hlavních bakterií způsobujících průjem na celém světě.Tyto bakterie mohou indukovat produkci IL-1p prostřednictvím P2X7 receptorem zprostředkovaného efluxu K+, reaktivních forem kyslíku, lysozomální acidifikace a mitochondriálního poškození.Inflammasom NLRP3 negativně reguluje fagocytózu a baktericidní aktivitu makrofágů proti Shigella [55].Studie Plasmodium ukázaly, že myši s deficitem AIM2, NLRP3 nebo kaspázy-1 infikované Plasmodium produkují vysoké hladiny interferonu typu 1 a jsou odolnější vůči infekci Plasmodium [56].Role alfa-2 giardinu a alfa-7,3 giardinu při indukci patogenní aktivace zánětu NLRP3 u myší je však nejasná.
V této studii inhibice inflamasomu NLRP3 pomocí MCC950 snížila BW a zvýšila počet trofozoitů ve střevní výplachové tekutině u myší, což mělo za následek závažnější patologické změny v duodenální tkáni.Alfa-2 giardin a alpha-7,3 giardin aktivují hostitelský myší zánět NLRP3, zvyšují tělesnou hmotnost myši, snižují počet trofozoitů ve střevní výplachové tekutině a zmírňují patologické duodenální léze.Tyto výsledky naznačují, že G. duodenalis může aktivovat inflamasom hostitele NLRP3 prostřednictvím alfa-2 giardinu a alfa-7,3 giardinu, čímž se snižuje patogenita G. duodenalis u myší.
Souhrnně naše výsledky ukazují, že alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukují aktivaci NLRP3 hostitelského inflamasomu a snižují infekčnost G. duodenalis u myší.Proto jsou tyto molekuly slibnými cíli pro prevenci giardiázy.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiáza: přehled.Nedávno se ukázalo, že Pat Inflamm je alergický na léky.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: přehled farmakoterapie.Odborný posudek lékárníka.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiáza, léková rezistence a objevování nových cílů.Infikuje cíle poruchy drog.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T atd. Zánětlivá a zánětlivá onemocnění NLRP3.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Role inflammasomu při střevních zánětech a rakovině.Gastroenterologie.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonická a atypická aktivace zánětu NLRP3 na křižovatce imunitní tolerance a zánětu střeva.preimunitní.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S a kol.Aktivace zánětu NLRP3 zprostředkovaná ROS se účastní reakce na infekci N. caninum.Vektor parazita.2020;13:449.