Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Genové vektory pro léčbu plicní cystické fibrózy musí být zacíleny na vodivé dýchací cesty, protože periferní plicní transdukce nemá žádný terapeutický účinek.Účinnost virové transdukce přímo souvisí s dobou zdržení nosiče.Avšak transportní tekutiny, jako jsou genové nosiče, přirozeně difundují do alveol během inhalace a terapeutické částice jakéhokoli tvaru jsou rychle odstraněny mukociliárním transportem.Prodloužení doby zdržení genových přenašečů v dýchacím traktu je důležité, ale obtížně dosažitelné.Magnetické částice konjugované s nosičem, které mohou být nasměrovány na povrch dýchacího traktu, mohou zlepšit regionální zacílení.Kvůli problémům se zobrazováním in vivo je chování takových malých magnetických částic na povrchu dýchacích cest v přítomnosti aplikovaného magnetického pole špatně pochopeno.Cílem této studie bylo použít synchrotronové zobrazování k vizualizaci in vivo pohybu řady magnetických částic v průdušnici anestetizovaných potkanů ​​za účelem studia dynamiky a vzorců chování jednotlivých a hromadných částic in vivo.Poté jsme také hodnotili, zda dodání lentivirových magnetických částic v přítomnosti magnetického pole zvýší účinnost transdukce v průdušnici potkana.Synchrotronové rentgenové zobrazování ukazuje chování magnetických částic ve stacionárních a pohyblivých magnetických polích in vitro a in vivo.Částice nelze snadno přetáhnout po povrchu živých dýchacích cest pomocí magnetů, ale při transportu se usazeniny soustřeďují v zorném poli, kde je magnetické pole nejsilnější.Účinnost transdukce byla také šestinásobně zvýšena, když byly lentivirové magnetické částice dodány v přítomnosti magnetického pole.Dohromady tyto výsledky naznačují, že lentivirové magnetické částice a magnetická pole mohou být cennými přístupy ke zlepšení cílení genových vektorů a úrovní transdukce ve vodivých dýchacích cestách in vivo.
Cystická fibróza (CF) je způsobena variacemi v jediném genu zvaném CF transmembránový regulátor vodivosti (CFTR).Protein CFTR je iontový kanál, který je přítomen v mnoha epiteliálních buňkách v celém těle, včetně dýchacích cest, což je hlavní místo v patogenezi cystické fibrózy.Defekty CFTR vedou k abnormálnímu transportu vody, dehydrataci povrchu dýchacích cest a snížení hloubky povrchové vrstvy tekutiny dýchacích cest (ASL).Zhoršuje také schopnost mukociliárního transportního systému (MCT) čistit dýchací cesty od vdechovaných částic a patogenů.Naším cílem je vyvinout lentivirovou (LV) genovou terapii, která dodá správnou kopii genu CFTR a zlepší ASL, MCT a zdraví plic, a pokračovat ve vývoji nových technologií, které mohou měřit tyto parametry in vivo1.
LV vektory jsou jedním z předních kandidátů pro genovou terapii cystické fibrózy, především proto, že mohou trvale integrovat terapeutický gen do bazálních buněk dýchacích cest (kmenových buněk dýchacích cest).To je důležité, protože mohou obnovit normální hydrataci a odstranění hlenu diferenciací na funkční genově korigované povrchové buňky dýchacích cest spojené s cystickou fibrózou, což má za následek celoživotní přínosy.LV vektory musí být namířeny proti vodivým dýchacím cestám, protože zde začíná postižení plic při CF.Dodání vektoru hlouběji do plic může vést k alveolární transdukci, ale to nemá žádný terapeutický účinek u cystické fibrózy.Tekutiny, jako jsou genové nosiče, však přirozeně migrují do alveol, když jsou vdechovány po porodu3,4 a terapeutické částice jsou rychle vypuzovány do dutiny ústní pomocí MCT.Účinnost transdukce LV přímo souvisí s délkou doby, po kterou vektor zůstává v blízkosti cílových buněk, aby umožnil buněčnou absorpci – „doba pobytu“ 5 , která se snadno zkracuje typickým regionálním prouděním vzduchu a také koordinovaným vychytáváním hlenu a částic MCT.U cystické fibrózy je schopnost prodloužit dobu setrvání LV v dýchacích cestách důležitá pro dosažení vysokých úrovní transdukce v této oblasti, ale dosud byla náročná.
Abychom tuto překážku překonali, navrhujeme, že magnetické částice LV (MP) mohou pomoci dvěma doplňkovými způsoby.Za prvé, mohou být vedeny magnetem k povrchu dýchacích cest, aby se zlepšilo zacílení a pomohly částicím genového nosiče být ve správné oblasti dýchacích cest;a ASL) se přesouvají do buněčné vrstvy 6. MP jsou široce používány jako cílená vehikula pro podávání léků, když se vážou na protilátky, chemoterapeutika nebo jiné malé molekuly, které se vážou na buněčné membrány nebo se vážou na jejich příslušné receptory na buněčném povrchu a hromadí se v místech nádoru přítomnost statické elektřiny.Magnetická pole pro léčbu rakoviny 7. Jiné „hypertermické“ metody jsou zaměřeny na zabíjení nádorových buněk zahříváním MP při vystavení oscilujícím magnetickým polím.Princip magnetické transfekce, kdy se magnetické pole používá jako transfekční činidlo pro posílení přenosu DNA do buněk, se běžně používá in vitro s použitím řady nevirových a virových genových vektorů pro obtížně transdukovatelné buněčné linie. ..Byla stanovena účinnost LV magnetotransfekce s dodáním LV MP in vitro do buněčné linie lidského bronchiálního epitelu v přítomnosti statického magnetického pole, což zvyšuje účinnost transdukce 186krát ve srovnání se samotným LV vektorem.LV MT byla také aplikována na in vitro model cystické fibrózy, kde magnetická transfekce zvýšila LV transdukci v kulturách na rozhraní vzduch-kapalina faktorem 20 v přítomnosti sputa cystické fibrózy10.Magnetotransfekci orgánů in vivo však byla věnována relativně malá pozornost a byla hodnocena pouze v několika studiích na zvířatech11,12,13,14,15, zejména v plicích16,17.Možnosti magnetické transfekce v plicní terapii u cystické fibrózy jsou však jasné.Tan a kol.(2020) uvedli, že „validační studie o účinném plicním dodávání magnetických nanočástic připraví cestu pro budoucí strategie inhalace CFTR ke zlepšení klinických výsledků u pacientů s cystickou fibrózou“6.
Chování malých magnetických částic na povrchu dýchacího traktu v přítomnosti aplikovaného magnetického pole je obtížné vizualizovat a studovat, a proto je špatně pochopeno.V jiných studiích jsme vyvinuli metodu synchrotronového šíření založeného na fázovém kontrastním rentgenovém zobrazování (PB-PCXI) pro neinvazivní zobrazování a kvantifikaci nepatrných in vivo změn v hloubce ASL18 a chování MCT1920 pro přímé měření povrchové hydratace plynového kanálu. a používá se jako časný indikátor účinnosti léčby.Naše skórovací metoda MCT navíc používá částice o průměru 10–35 µm složené z oxidu hlinitého nebo skla s vysokým indexem lomu jako MCT markery viditelné pomocí PB-PCXI21.Obě metody jsou vhodné pro zobrazování řady typů částic, včetně MP.
Díky vysokému prostorovému a časovému rozlišení jsou naše testy ASL a MCT založené na PB-PCXI dobře vhodné pro studium dynamiky a vzorců chování jednotlivých a hromadných částic in vivo, aby nám pomohly porozumět a optimalizovat metody dodávání genů MP.Přístup, který zde používáme, je založen na našich studiích využívajících paprskovou linii SPring-8 BL20B2, ve které jsme vizualizovali pohyb tekutiny po podání dávky falešného vektoru do nosních a plicních cest myší, abychom pomohli vysvětlit naše pozorované heterogenní vzorce genové exprese. v našem genu.studie na zvířatech s dávkou nosiče 3,4 .
Cílem této studie bylo použít synchrotron PB-PCXI k vizualizaci in vivo pohybů řady MP v průdušnici živých krys.Tyto zobrazovací studie PB-PCXI byly navrženy tak, aby otestovaly řadu MP, sílu magnetického pole a umístění, aby se určil jejich účinek na pohyb MP.Předpokládali jsme, že vnější magnetické pole pomůže dodanému MF zůstat nebo se přesunout do cílové oblasti.Tyto studie nám také umožnily určit konfigurace magnetů, které maximalizují množství částic ponechaných v průdušnici po uložení.Ve druhé sérii studií jsme se zaměřili na použití této optimální konfigurace k demonstraci transdukčního vzoru vyplývajícího z in vivo dodávání LV-MPs do dýchacích cest potkana, za předpokladu, že dodání LV-MPs v kontextu cílení dýchacích cest by mělo za následek ve zvýšené účinnosti transdukce LV..
Všechny studie na zvířatech byly provedeny v souladu s protokoly schválenými Univerzitou v Adelaide (M-2019-060 a M-2020-022) a Etickým výborem pro Synchrotron zvířat SPring-8.Experimenty byly provedeny v souladu s doporučeními ARRIVE.
Všechny rentgenové snímky byly pořízeny na paprskové linii BL20XU na synchrotronu SPring-8 v Japonsku s použitím nastavení podobného tomu, které bylo popsáno dříve21,22.Stručně řečeno, experimentální box byl umístěn 245 m od prstence uložení synchrotronu.Vzdálenost mezi vzorkem a detektorem 0,6 m se používá pro studie zobrazování částic a 0,3 m pro studie zobrazování in vivo k vytvoření efektů fázového kontrastu.Byl použit monochromatický paprsek s energií 25 keV.Snímky byly pořízeny pomocí rentgenového převodníku s vysokým rozlišením (SPring-8 BM3) spojeného s detektorem sCMOS.Převodník převádí rentgenové záření na viditelné světlo pomocí scintilátoru o tloušťce 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), který je poté nasměrován na snímač sCMOS pomocí objektivu mikroskopu ×10 (NA 0,3).Detektor sCMOS byl Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonsko) s velikostí pole 2048 × 2048 pixelů a hrubou velikostí pixelů 6,5 × 6,5 µm.Toto nastavení poskytuje efektivní izotropní velikost pixelu 0,51 µm a zorné pole přibližně 1,1 mm × 1,1 mm.Délka expozice 100 ms byla zvolena tak, aby se maximalizoval poměr signálu k šumu magnetických částic uvnitř a vně dýchacích cest a zároveň se minimalizovaly pohybové artefakty způsobené dýcháním.Pro studie in vivo byla do dráhy rentgenového záření umístěna rychlá rentgenová závěrka, aby se omezila dávka záření blokováním rentgenového paprsku mezi expozicemi.
Médium LV nebylo použito v žádné zobrazovací studii SPring-8 PB-PCXI, protože zobrazovací komora BL20XU nemá certifikaci úrovně biologické bezpečnosti 2.Místo toho jsme vybrali řadu dobře charakterizovaných MP od dvou komerčních prodejců pokrývajících řadu velikostí, materiálů, koncentrací železa a aplikací, — nejprve abychom pochopili, jak magnetická pole ovlivňují pohyb MP ve skleněných kapilárách, a poté v živé dýchací cesty.povrch.Velikost MP se pohybuje od 0,25 do 18 µm a je vyrobena z různých materiálů (viz tabulka 1), ale složení každého vzorku, včetně velikosti magnetických částic v MP, není známo.Na základě našich rozsáhlých studií MCT 19, 20, 21, 23, 24 očekáváme, že MP do 5 µm lze vidět na povrchu tracheálních dýchacích cest, například odečtením po sobě jdoucích snímků, abychom viděli lepší viditelnost pohybu MP.Jediný MP 0,25 µm je menší než rozlišení zobrazovacího zařízení, ale očekává se, že PB-PCXI bude detekovat jejich objemový kontrast a pohyb povrchové kapaliny, na které jsou naneseny po nanesení.
Vzorky pro každého MP v tabulce.1 byl připraven ve 20 μl skleněných kapilárách (Drummond Microcaps, PA, USA) o vnitřním průměru 0,63 mm.Korpuskulární částice jsou dostupné ve vodě, zatímco částice CombiMag jsou k dispozici ve vlastní kapalině výrobce.Každá zkumavka je do poloviny naplněna kapalinou (přibližně 11 µl) a umístěna na držák vzorku (viz obrázek 1).Skleněné kapiláry byly umístěny horizontálně na stolek v zobrazovací komoře a umístěny na okrajích kapaliny.Nikl-shell magnet o průměru 19 mm (28 mm dlouhý) vyrobený ze vzácných zemin, neodymu, železa a bóru (NdFeB) (N35, kat. č. LM1652, Jaycar Electronics, Austrálie) s remanencí 1,17 T byl připevněn k samostatný přenosový stůl k dosažení Vzdáleně změnit polohu během vykreslování.Rentgenové zobrazování začíná, když je magnet umístěn přibližně 30 mm nad vzorkem a snímky jsou pořizovány rychlostí 4 snímky za sekundu.Během zobrazování byl magnet přiveden do blízkosti skleněné kapiláry (na vzdálenost asi 1 mm) a poté se pohyboval podél trubice, aby se vyhodnotil vliv intenzity pole a polohy.
Zobrazovací sestava in vitro obsahující vzorky MP ve skleněných kapilárách ve fázi translace vzorku xy.Dráha rentgenového paprsku je vyznačena červenou tečkovanou čarou.
Jakmile byla stanovena viditelnost MPs in vitro, byla jejich podskupina testována in vivo na samicích potkanů ​​Wistar albino divokého typu (~12 týdnů staré, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonsko), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonsko) a butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Krysy byly anestetizovány směsí Pharma (Japonsko) intraperitoneální injekcí.Po anestezii byli připraveni k zobrazení odstraněním srsti kolem průdušnice, zavedením endotracheální trubice (ET; 16 Ga intravenózní kanyla, Terumo BCT) a imobilizací v poloze na zádech na zakázkově vyrobené zobrazovací destičce obsahující termotašku. k udržení tělesné teploty.22. Zobrazovací destička byla poté připojena ke vzorkovému stolku v zobrazovacím boxu pod mírným úhlem, aby se průdušnice vyrovnala horizontálně na rentgenovém snímku, jak je znázorněno na obrázku 2a.
(a) Nastavení zobrazování in vivo v zobrazovací jednotce SPring-8, dráha rentgenového paprsku označená červenou tečkovanou čarou.(b,c) Lokalizace tracheálního magnetu byla provedena na dálku pomocí dvou ortogonálně namontovaných IP kamer.Na levé straně obrázku na obrazovce můžete vidět drátěnou smyčku držící hlavici a zaváděcí kanylu nainstalovanou uvnitř ET trubice.
Dálkově ovládaný injekční pumpový systém (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) používající 100 ul skleněné injekční stříkačky byl připojen k PE10 hadičce (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) pomocí 30 Ga jehly.Označte si trubici, abyste se ujistili, že při zavádění endotracheální trubice je špička ve správné poloze v průdušnici.Pomocí mikropumpy byl odstraněn píst injekční stříkačky a špička zkumavky byla ponořena do MP vzorku, který měl být dodán.Zatížená zaváděcí trubice byla poté vložena do endotracheální trubice a její špička byla umístěna do nejsilnější části našeho očekávaného aplikovaného magnetického pole.Získávání snímků bylo řízeno pomocí detektoru dechu připojeného k našemu časovacímu boxu založenému na Arduinu a všechny signály (např. teplota, dýchání, otevření/zavření závěrky a pořízení snímku) byly zaznamenány pomocí Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrálie) 22 Při snímkování Když nebylo pouzdro k dispozici, byly dvě IP kamery (Panasonic BB-SC382) umístěny v úhlu přibližně 90° vůči sobě a použity k ovládání polohy magnetu vzhledem k průdušnici během snímkování (obrázek 2b, c).Aby se minimalizovaly pohybové artefakty, byl pořízen jeden snímek na dech během koncového plató respiračního průtoku.
Magnet je připojen k druhému stupni, který může být umístěn vzdáleně na vnější straně zobrazovacího tělesa.Byly testovány různé polohy a konfigurace magnetu, včetně: umístění v úhlu přibližně 30° nad průdušnicí (konfigurace jsou znázorněny na obrázcích 2a a 3a);jeden magnet nad zvířetem a druhý dole, s póly nastavenými pro přitahování (obrázek 3b)., jeden magnet nad zvířetem a jeden dole, s póly nastavenými na odpuzování (obrázek 3c) a jeden magnet nad a kolmo k průdušnici (obrázek 3d).Po nastavení zvířete a magnetu a naložení testovaného MP do injekční pumpy aplikujte dávku 50 µl rychlostí 4 µl/s po získání snímků.Magnet se pak pohybuje tam a zpět podél nebo přes průdušnici, zatímco pokračuje v získávání snímků.
Konfigurace magnetu pro zobrazování in vivo (a) jeden magnet nad průdušnicí pod úhlem přibližně 30°, (b) dva magnety konfigurované pro přitahování, (c) dva magnety konfigurované pro odpuzování, (d) jeden magnet nad průdušnicí a kolmo k ní průdušnice.Pozorovatel se podíval dolů z úst do plic skrz průdušnici a rentgenový paprsek prošel levou stranou krysy a vyšel pravou stranou.Magnet se pohybuje buď po délce dýchacích cest nebo vlevo a vpravo nad průdušnicí ve směru paprsku rentgenového záření.
Snažili jsme se také určit viditelnost a chování částic v dýchacích cestách při absenci míšení dýchání a srdeční frekvence.Na konci období zobrazování byla proto zvířata humánně usmrcena v důsledku předávkování pentobarbitalem (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Některá zvířata byla ponechána na zobrazovací platformě a po zastavení dýchání a srdečního tepu byl proces zobrazování opakován s přidáním další dávky MP, pokud na povrchu dýchacích cest nebyl viditelný žádný MP.
Výsledné snímky byly korigovány na ploché a tmavé pole a poté složeny do filmu (20 snímků za sekundu; 15–25 × normální rychlost v závislosti na frekvenci dýchání) pomocí vlastního skriptu napsaného v MATLABu (R2020a, The Mathworks).
Všechny studie o doručení genového vektoru LV byly provedeny na University of Adelaide Laboratory Animal Research Center a jejich cílem bylo použít výsledky experimentu SPring-8 k posouzení, zda dodání LV-MP v přítomnosti magnetického pole může zvýšit přenos genů in vivo. .Pro vyhodnocení účinků MF a magnetického pole byly ošetřeny dvě skupiny zvířat: jedné skupině byla injekčně podána LV MF s umístěním magnetu a druhé skupině byla injekčně podána kontrolní skupina LV MF bez magnetu.
LV genové vektory byly vytvořeny za použití dříve popsaných metod25,26.Vektor LacZ exprimuje v jádře lokalizovaný gen beta-galaktosidázy řízený konstitutivním promotorem MPSV (LV-LacZ), který produkuje modrý reakční produkt v transdukovaných buňkách, viditelný na frontách a řezech plicní tkáně.Titrace byla provedena v buněčných kulturách manuálním spočítáním počtu LacZ-pozitivních buněk pomocí hemocytometru pro výpočet titru v TU/ml.Nosiče jsou kryokonzervovány při -80 °C, před použitím rozmraženy a navázány na CombiMag smícháním 1:1 a inkubací na ledu po dobu alespoň 30 minut před dodáním.
Normální krysy Sprague Dawley (n = 3/skupina, ~2-3 anestetizované ip směsí 0,4 mg/kg medetomidinu (Domitor, Ilium, Austrálie) a 60 mg/kg ketaminu (Ilium, Austrálie) ve věku 1 měsíce) ip ) injekční a nechirurgická perorální kanyla s 16 Ga intravenózní kanylou.Aby se zajistilo, že tkáň tracheálních dýchacích cest přijímá LV transdukci, byla kondicionována pomocí našeho dříve popsaného protokolu mechanické perturbace, ve kterém byl povrch tracheálních dýchacích cest axiálně třen drátěným košem (N-Circle, nitinolový extraktor kamenů bez špičky NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Poté, asi 10 minut po perturbaci v kabinetu biologické bezpečnosti, bylo provedeno tracheální podání LV-MP.
Magnetické pole použité v tomto experimentu bylo konfigurováno podobně jako při rentgenové studii in vivo, se stejnými magnety drženými nad průdušnicí pomocí svorek destilačního stentu (obrázek 4).Objem 50 ul (2 x 25 ul alikvoty) LV-MP byl dodán do průdušnice (n = 3 zvířata) pomocí gelem zakončené pipety, jak bylo popsáno dříve.Kontrolní skupině (n = 3 zvířata) byl podán stejný LV-MP bez použití magnetu.Po dokončení infuze se kanyla vyjme z endotracheální trubice a zvíře se extubuje.Magnet zůstane na místě po dobu 10 minut, než se odstraní.Krysám byl subkutánně podáván meloxikam (1 ml/kg) (Ilium, Austrálie) s následným vysazením anestezie intraperitoneální injekcí 1 mg/kg atipamazol hydrochloridu (Antisedan, Zoetis, Austrálie).Krysy byly udržovány v teple a pozorovány až do úplného zotavení z anestezie.
Aplikační zařízení LV-MP v biologické bezpečnostní skříni.Můžete vidět, že světle šedá objímka Luer-lock trubice ET vyčnívá z úst a špička gelové pipety zobrazená na obrázku je vložena trubicí ET do požadované hloubky do průdušnice.
Jeden týden po proceduře podání LV-MP byla zvířata humánně usmrcena inhalací 100% CO2 a exprese LacZ byla hodnocena pomocí naší standardní léčby X-gal.Tři nejvíce ocasní prstence chrupavky byly odstraněny, aby se zajistilo, že jakékoli mechanické poškození nebo zadržování tekutin v důsledku umístění endotracheální trubice nebude zahrnuto do analýzy.Každá průdušnice byla podélně rozříznuta, aby se získaly dvě poloviny pro analýzu, a umístěna do kalíšku obsahujícího silikonový kaučuk (Sylgard, Dow Inc) za použití jehly Minutien (Fine Science Tools) pro vizualizaci luminálního povrchu.Distribuce a charakter transdukovaných buněk byly potvrzeny frontální fotografií pomocí mikroskopu Nikon (SMZ1500) s kamerou DigiLite a softwarem TCapture (Tucsen Photonics, Čína).Snímky byly pořízeny při 20násobném zvětšení (včetně maximálního nastavení pro celou šířku průdušnice), přičemž celá délka průdušnice byla zobrazena krok za krokem, což poskytlo dostatečné překrytí mezi jednotlivými snímky, aby bylo možné snímky „sšít“.Obrazy z každé průdušnice byly poté zkombinovány do jednoho kompozitního obrazu pomocí Composite Image Editor verze 2.0.3 (Microsoft Research) s použitím algoritmu planárního pohybu. Oblast exprese LacZ v tracheálních kompozitních obrazech od každého zvířete byla kvantifikována pomocí automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak bylo popsáno dříve28, s použitím nastavení 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7. Oblast exprese LacZ v tracheálních kompozitních obrazech od každého zvířete byla kvantifikována pomocí automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak bylo popsáno dříve28, s použitím nastavení 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7. Площадь экспрессси Lacz составных ззображениях трахеи от каждого жн к к т т т т т оматизированного сценариb (r2020a, Mathworks), как описано ранее28, и и puštěně н н puštěně значение <0 ,7. Oblast exprese LacZ ve složených tracheálních obrázcích od každého zvířete byla kvantifikována pomocí automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak bylo popsáno dříve28 s nastavením 0,350,15 a hodnota<0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图物的气管复合图管复合图羾复合侾进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来燪 每 只 的 气管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... BOKY Области экспрессии lacz на составных изображениях трахеи кажжого живл о и и и и и и и с рованного цценария Matlab (R2020a, Mathworks), как описано ранее, с и с с с с с с и 0,35 о moutna <0,7 . Oblasti exprese LacZ na kompozitních snímcích průdušnice každého zvířete byly kvantifikovány pomocí automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak bylo popsáno dříve, s použitím nastavení 0,35 < odstín < 0,58, saturace > 0,15 a hodnota < 0,7.Sledováním obrysů tkáně v GIMP v2.10.24 byla pro každý složený snímek ručně vytvořena maska, která identifikovala oblast tkáně a zabránila falešným detekcím mimo tracheální tkáň.Obarvené plochy ze všech složených snímků od každého zvířete byly sečteny, aby se získala celková obarvená plocha pro toto zvíře.Natřená plocha byla poté rozdělena celkovou plochou masky, aby se získala normalizovaná plocha.
Každá průdušnice byla zalita v parafínu a nařezána na řezy o tloušťce 5 um.Řezy byly kontrastně obarveny neutrální rychlou červení po dobu 5 minut a snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 a softwaru pro zachycení prvků NIS (verze 5.20.00).
Všechny statistické analýzy byly provedeny v GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistická významnost byla stanovena na p < 0,05.Normalita byla testována pomocí Shapiro-Wilkova testu a rozdíly v barvení LacZ byly hodnoceny pomocí nepárového t-testu.
Šest MP popsaných v tabulce 1 bylo zkoumáno pomocí PCXI a viditelnost je popsána v tabulce 2. Dva polystyrenové MP (MP1 a MP2; 18 µm a 0,25 µm, v tomto pořadí) nebyly pomocí PCXI viditelné, ale zbývající vzorky bylo možné identifikovat (příklady jsou uvedeny na obrázku 5).MP3 a MP4 jsou slabě viditelné (10-15 % Fe3O4; 0,25 µm a 0,9 µm, v tomto pořadí).Ačkoli MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) obsahoval některé z nejmenších testovaných částic, byl nejvýraznější.Produkt CombiMag MP6 je obtížné rozlišit.Ve všech případech se naše schopnost detekovat MF výrazně zlepšila pohybem magnetu tam a zpět paralelně s kapilárou.Když se magnety vzdalovaly od kapiláry, částice byly vytahovány v dlouhých řetězcích, ale jak se magnety přibližovaly a síla magnetického pole se zvyšovala, řetězce částic se zkracovaly, jak částice migrovaly směrem k hornímu povrchu kapiláry (viz doplňkové video S1 : MP4), zvýšení hustoty částic na povrchu.Naopak, když je magnet z kapiláry odstraněn, intenzita pole klesá a MP se přeskupují do dlouhých řetězců vybíhajících z horního povrchu kapiláry (viz doplňkové video S2: MP4).Poté, co se magnet zastaví, částice se pohybují ještě nějakou dobu po dosažení rovnovážné polohy.Jak se MP pohybuje směrem k hornímu povrchu kapiláry a od něj, magnetické částice mají tendenci vtahovat úlomky skrz kapalinu.
Viditelnost MP pod PCXI se mezi vzorky značně liší.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Všechny zde zobrazené snímky byly pořízeny magnetem umístěným přibližně 10 mm přímo nad kapilárou.Zdánlivě velké kruhy jsou vzduchové bubliny zachycené v kapilárách, které jasně ukazují černobílé okrajové rysy snímku s fázovým kontrastem.Červený rámeček označuje zvětšení, které zvyšuje kontrast.Všimněte si, že průměry magnetických obvodů na všech obrázcích nejsou v měřítku a jsou přibližně 100krát větší, než je znázorněno.
Jak se magnet pohybuje vlevo a vpravo podél horní části kapiláry, mění se úhel MP řetězce tak, aby byl zarovnán s magnetem (viz obrázek 6), čímž se vymezují magnetické siločáry.U MP3-5, poté, co tětiva dosáhne prahového úhlu, se částice táhnou podél horního povrchu kapiláry.To často vede k tomu, že se MP shlukují do větších skupin poblíž místa, kde je magnetické pole nejsilnější (viz doplňkové video S3: MP5).To je také zvláště patrné při zobrazování blízko konce kapiláry, což způsobuje agregaci a koncentraci MP na rozhraní kapalina-vzduch.Částice v MP6, které byly hůře rozlišitelné než ty v MP3-5, se netáhly, když se magnet pohyboval podél kapiláry, ale struny MP se disociovaly, takže částice byly v dohledu (viz doplňkové video S4: MP6).V některých případech, kdy bylo aplikované magnetické pole redukováno pohybem magnetu na velkou vzdálenost od zobrazovacího místa, všechny zbývající MPs pomalu sestoupily ke spodnímu povrchu trubice gravitací a zůstaly ve struně (viz doplňkové video S5: MP3) .
Úhel MP struny se mění, když se magnet pohybuje doprava nad kapilárou.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Červený rámeček označuje zvětšení, které zvyšuje kontrast.Vezměte prosím na vědomí, že další videa jsou pro informační účely, protože odhalují důležitou strukturu částic a dynamické informace, které nelze na těchto statických obrázcích zobrazit.
Naše testy ukázaly, že pomalý pohyb magnetu tam a zpět podél průdušnice usnadňuje vizualizaci MF v kontextu komplexního pohybu in vivo.Nebyly provedeny žádné in vivo testy, protože polystyrenové kuličky (MP1 a MP2) nebyly v kapiláře viditelné.Každý ze zbývajících čtyř MF byl testován in vivo s dlouhou osou magnetu umístěného nad průdušnicí v úhlu asi 30° k vertikále (viz obrázky 2b a 3a), protože to vedlo k delším MF řetězcům a bylo účinnější. než magnet..konfigurace ukončena.MP3, MP4 a MP6 nebyly nalezeny v průdušnici žádného živého zvířete.Při vizualizaci dýchacího traktu krys po humánním zabití zvířat zůstaly částice neviditelné, i když byl přidán další objem pomocí injekční pumpy.MP5 měl nejvyšší obsah oxidu železa a byl jedinou viditelnou částicí, takže byl použit k hodnocení a charakterizaci chování MP in vivo.
Umístění magnetu nad průdušnici během zavádění MF vedlo k tomu, že se mnoho, ale ne všechny, MF koncentrovalo v zorném poli.Tracheální vstup částic lze nejlépe pozorovat u humánně utracených zvířat.Obrázek 7 a doplňkové video S6: MP5 ukazuje rychlé magnetické zachycení a zarovnání částic na povrchu ventrální průdušnice, což naznačuje, že MP mohou být zacíleny do požadovaných oblastí průdušnice.Při hledání více distálně podél průdušnice po podání MF byly některé MF nalezeny blíže ke karině, což ukazuje na nedostatečnou sílu magnetického pole pro zachycení a zadržení všech MF, protože byly dodány přes oblast maximální síly magnetického pole během podávání tekutiny.proces.Nicméně postnatální koncentrace MP byly vyšší v oblasti snímku, což naznačuje, že mnoho MP zůstalo v oblastech dýchacích cest, kde byla síla aplikovaného magnetického pole nejvyšší.
Obrázky (a) před a (b) po aplikaci MP5 do průdušnice nedávno usmrcené krysy s magnetem umístěným těsně nad zobrazovací oblastí.Vyobrazená oblast se nachází mezi dvěma chrupavčitými prstenci.Před dodáním MP je v dýchacích cestách určité množství tekutiny.Červený rámeček označuje zvětšení, které zvyšuje kontrast.Tyto obrázky jsou převzaty z videa v S6: MP5 Supplementary Video.
Pohyb magnetu podél průdušnice in vivo měl za následek změnu úhlu MP řetězce na povrchu dýchacích cest, podobnou té, která byla pozorována v kapilárách (viz obrázek 8 a doplňkové video S7: MP5).V naší studii však MP nemohly být taženy po povrchu živých dýchacích cest, jak to mohou dělat kapiláry.V některých případech se řetěz MP prodlužuje, když se magnet pohybuje doleva a doprava.Je zajímavé, že jsme také zjistili, že řetězec částic mění hloubku povrchové vrstvy tekutiny, když se magnet pohybuje podélně podél průdušnice, a expanduje, když se magnet pohybuje přímo nad hlavou a řetězec částic je otočen do vertikální polohy (viz. Doplňkové video S7).: MP5 v 0:09, vpravo dole).Charakteristický pohybový vzorec se změnil, když byl magnet posunut laterálně přes horní část průdušnice (tj. doleva nebo doprava od zvířete, spíše než podél délky průdušnice).Částice byly během jejich pohybu stále jasně viditelné, ale když byl magnet odstraněn z průdušnice, byly vidět konce řetězců částic (viz doplňkové video S8: MP5, počínaje 0:08).To souhlasí s pozorovaným chováním magnetického pole při působení aplikovaného magnetického pole ve skleněné kapiláře.
Ukázkové obrázky ukazující MP5 v průdušnici živé anestetizované krysy.(a) Magnet se používá k získání snímků nad a nalevo od průdušnice, poté (b) po přesunutí magnetu doprava.Červený rámeček označuje zvětšení, které zvyšuje kontrast.Tyto obrázky jsou z videa obsaženého v doplňkovém videu S7: MP5.
Když byly dva póly naladěny v severojižní orientaci nad a pod průdušnicí (tj. přitahování; obr. 3b), struny MP se jevily delší a byly umístěny spíše na boční stěně průdušnice než na dorzálním povrchu trachey. průdušnice (viz příloha).Video S9:MP5).Vysoké koncentrace částic na jednom místě (tj. na dorzálním povrchu průdušnice) však nebyly detekovány po podání tekutiny pomocí zařízení s duálním magnetem, ke kterému obvykle dochází u zařízení s jedním magnetem.Poté, když byl jeden magnet nakonfigurován tak, aby odpuzoval opačné póly (obrázek 3c), počet částic viditelných v zorném poli se po dodání nezvýšil.Nastavení obou dvou konfigurací magnetů je náročné kvůli vysoké intenzitě magnetického pole, které magnety přitahuje nebo tlačí.Nastavení bylo poté změněno na jeden magnet rovnoběžný s dýchacími cestami, ale procházející dýchacími cestami pod úhlem 90 stupňů, takže siločáry protínaly tracheální stěnu ortogonálně (obrázek 3d), což je orientace určená k určení možnosti agregace částic na boční stěna.být pozorován.V této konfiguraci však nedošlo k žádnému identifikovatelnému pohybu akumulace MF nebo pohybu magnetu.Na základě všech těchto výsledků byla pro in vivo studie nosičů genů zvolena konfigurace s jedním magnetem a 30stupňovou orientací (obr. 3a).
Když bylo zvíře vícekrát zobrazeno bezprostředně poté, co bylo humánně utraceno, nepřítomnost rušivého pohybu tkáně znamenala, že v jasném mezichrupavčitém poli bylo možné rozeznat jemnější, kratší linie částic, které se „kývaly“ v souladu s translačním pohybem magnetu.jasně vidět přítomnost a pohyb částic MP6.
Titr LV-LacZ byl 1,8 x 108 IU/ml a po smíchání 1:1 s CombiMag MP (MP6) bylo zvířatům injikováno 50 ul tracheální dávky 9 x 107 IU/ml LV vehikula (tj. 4,5 x 106 TU/krysa).).).V těchto studiích jsme místo pohybu magnetu během porodu upevnili magnet do jedné polohy, abychom určili, zda lze transdukci LV (a) zlepšit ve srovnání s vektorovým podáním v nepřítomnosti magnetického pole a (b) zda by dýchací cesty mohly soustředit se.Buňky jsou transdukovány v magnetických cílových oblastech horních cest dýchacích.
Nezdálo se, že by přítomnost magnetů a použití CombiMag v kombinaci s LV vektory nepříznivě ovlivnilo zdraví zvířat, stejně jako náš standardní protokol pro dodávání LV vektorů.Frontální snímky tracheální oblasti vystavené mechanické perturbaci (doplňkový obr. 1) ukázaly, že skupina léčená LV-MP měla významně vyšší úrovně transdukce v přítomnosti magnetu (obr. 9a).V kontrolní skupině bylo přítomno pouze malé množství modrého barvení LacZ (obrázek 9b).Kvantifikace normalizovaných oblastí obarvených X-Gal ukázala, že podávání LV-MP v přítomnosti magnetického pole vedlo k přibližně 6násobnému zlepšení (obr. 9c).
Příklad kompozitních snímků ukazujících tracheální transdukci pomocí LV-MP (a) v přítomnosti magnetického pole a (b) v nepřítomnosti magnetu.(c) Statisticky významné zlepšení v normalizované oblasti přenosu LacZ v průdušnici s použitím magnetu (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupinu, průměr ± standardní chyba průměru).
Neutrální rychle červeně obarvené řezy (příklad ukázaný na doplňkovém obrázku 2) indikovaly, že buňky barvené LacZ byly přítomny ve stejném vzorku a na stejném místě, jak bylo uvedeno dříve.
Klíčovou výzvou v genové terapii dýchacích cest zůstává přesná lokalizace nosných částic v oblastech zájmu a dosažení vysoké úrovně účinnosti transdukce v mobilních plicích za přítomnosti proudění vzduchu a aktivního odstraňování hlenu.Pro nosiče LV určené k léčbě respiračních onemocnění při cystické fibróze bylo zvýšení doby setrvání částic nosiče ve vodivých dýchacích cestách dosud nedosažitelným cílem.Jak zdůraznil Castellani et al., použití magnetických polí ke zvýšení transdukce má výhody oproti jiným metodám dodávání genů, jako je elektroporace, protože může kombinovat jednoduchost, hospodárnost, lokalizované dodání, zvýšenou účinnost a kratší dobu inkubace.a možná nižší dávka vehikula10.Ukládání a chování magnetických částic v dýchacích cestách in vivo pod vlivem vnějších magnetických sil však nebylo nikdy popsáno a ve skutečnosti nebyla in vivo prokázána schopnost této metody zvýšit hladiny genové exprese v intaktních živých dýchacích cestách.
Naše in vitro experimenty na PCXI synchrotronu ukázaly, že všechny námi testované částice, s výjimkou MP polystyrenu, byly viditelné v zobrazovacím nastavení, které jsme použili.Magnetická pole tvoří za přítomnosti magnetického pole provázky, jejichž délka souvisí s typem částic a silou magnetického pole (tj. blízkostí a pohybem magnetu).Jak je znázorněno na obrázku 10, struny, které pozorujeme, se tvoří, když se každá jednotlivá částice zmagnetizuje a indukuje své vlastní lokální magnetické pole.Tato oddělená pole způsobují, že se další podobné částice shromažďují a spojují se skupinovými pohyby strun v důsledku místních sil z místních sil přitahování a odpuzování jiných částic.
Diagram znázorňující (a, b) řetězce částic tvořících se uvnitř kapilár naplněných tekutinou a (c, d) vzduchem naplněnou průdušnici.Všimněte si, že kapiláry a průdušnice nejsou nakresleny v měřítku.Panel (a) také obsahuje popis MF obsahující částice Fe3O4 uspořádané do řetězců.
Když se magnet přesunul přes kapiláru, dosáhl úhel částice struny kritické prahové hodnoty pro MP3-5 obsahující Fe3O4, po které již struna částic nezůstávala ve své původní poloze, ale pohybovala se po povrchu do nové polohy.magnet.K tomuto efektu pravděpodobně dochází, protože povrch skleněné kapiláry je dostatečně hladký, aby umožnil tento pohyb.Zajímavé je, že MP6 (CombiMag) se takto nechoval, možná proto, že částice byly menší, měly jiný povlak nebo povrchový náboj nebo jejich schopnost pohybu ovlivňovala patentovaná nosná kapalina.Kontrast v obrazu částic CombiMag je také slabší, což naznačuje, že kapalina a částice mohou mít stejnou hustotu, a proto se nemohou snadno pohybovat směrem k sobě.Částice se také mohou zaseknout, pokud se magnet pohybuje příliš rychle, což naznačuje, že síla magnetického pole nemůže vždy překonat tření mezi částicemi v tekutině, což naznačuje, že síla magnetického pole a vzdálenost mezi magnetem a cílovou oblastí by neměly být překvapení.Důležité.Tyto výsledky také naznačují, že ačkoli magnety dokážou zachytit mnoho mikročástic proudících cílovou oblastí, je nepravděpodobné, že se na magnety lze spolehnout při pohybu částic CombiMag po povrchu průdušnice.Došli jsme tedy k závěru, že studie LV MF in vivo by měly používat statická magnetická pole k fyzickému zacílení na specifické oblasti stromu dýchacích cest.
Jakmile jsou částice dopraveny do těla, je obtížné je identifikovat v kontextu komplexní pohyblivé tkáně těla, ale jejich detekční schopnost byla vylepšena pohybem magnetu vodorovně přes průdušnici, aby se „rozvibrovaly“ struny MP.I když je možné zobrazování v reálném čase, je snazší rozeznat pohyb částic poté, co bylo zvíře humánně zabito.Koncentrace MP byly obvykle nejvyšší v tomto místě, když byl magnet umístěn nad zobrazovací oblastí, ačkoli některé částice byly obvykle nalezeny dále v průdušnici.Na rozdíl od studií in vitro nemohou být částice taženy dolů tracheou pohybem magnetu.Toto zjištění je v souladu s tím, jak hlen, který pokrývá povrch průdušnice, typicky zpracovává vdechované částice, zachycuje je v hlenu a následně je čistí prostřednictvím mechanismu muko-ciliární clearance.
Předpokládali jsme, že použití magnetů nad a pod průdušnicí pro přitahování (obr. 3b) by mohlo vést k rovnoměrnějšímu magnetickému poli, spíše než k magnetickému poli, které je vysoce koncentrované v jednom bodě, což může potenciálně vést k rovnoměrnější distribuci částic..Naše předběžná studie však nenašla jasné důkazy na podporu této hypotézy.Podobně nastavení dvojice magnetů na odpuzování (obr. 3c) nevedlo k většímu usazování částic v oblasti snímku.Tato dvě zjištění ukazují, že nastavení duálního magnetu významně nezlepšuje místní ovládání ukazování MP a že výsledné silné magnetické síly je obtížné vyladit, což činí tento přístup méně praktickým.Podobně orientace magnetu nad a přes průdušnici (obrázek 3d) také nezvýšila počet částic zbývajících v zobrazené oblasti.Některé z těchto alternativních konfigurací nemusí být úspěšné, protože vedou ke snížení intenzity magnetického pole v depoziční zóně.Konfigurace s jedním magnetem při 30 stupních (obr. 3a) je tedy považována za nejjednodušší a nejúčinnější testovací metodu in vivo.
Studie LV-MP ukázala, že když byly vektory LV kombinovány s CombiMag a aplikovány poté, co byly fyzicky narušeny přítomností magnetického pole, hladiny transdukce v průdušnici významně vzrostly ve srovnání s kontrolami.Na základě synchrotronových zobrazovacích studií a výsledků LacZ se zdálo, že magnetické pole je schopno udržet LV v průdušnici a snížit počet vektorových částic, které okamžitě pronikly hluboko do plic.Taková zlepšení cílení mohou vést k vyšší účinnosti a zároveň snížit dodané titry, necílenou transdukci, zánětlivé a imunitní vedlejší účinky a náklady na přenos genů.Důležité je, že podle výrobce lze CombiMag použít v kombinaci s jinými metodami přenosu genů, včetně jiných virových vektorů (jako je AAV) a nukleových kyselin.