Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Toxoplasma gondii je intracelulární prvokový parazit, který moduluje mikroprostředí infikovaného hostitele a je známo, že je spojen s výskytem růstu mozkového nádoru.V této studii předpokládáme, že exosomální miRNA-21 z infekce Toxoplasma podporuje růst mozkového nádoru.Byly charakterizovány exosomy z mikroglií BV2 infikovaných toxoplasmou a byla potvrzena internalizace gliomových buněk U87.Exosomální profily exprese mikroRNA byly analyzovány pomocí čipů microRNA a microRNA-21A-5p spojených s Toxoplasma gondii a tříděním nádorů.Také jsme zkoumali hladiny mRNA genů asociovaných s nádorem v gliomových buňkách U87 změnou hladin miR-21 v exozomech a vliv exozomů na proliferaci lidských gliomových buněk U87.V exozomech gliomových buněk U87 infikovaných Toxoplasma gondii je zvýšená exprese mikroRNA-21 a snížena aktivita protinádorových genů (FoxO1, PTEN a PDCD4).Exozomy odvozené od BV2 infikované toxoplasmou indukují proliferaci buněk gliomu U87.Exosomy indukují růst buněk U87 v modelu myšího nádoru.Navrhujeme, že zvýšený exosomální miR-21 v mikrogliích BV2 infikovaných toxoplasmou může hrát důležitou roli jako promotor buněčného růstu v buňkách gliomu U87 snížením regulace protinádorových genů.
Odhaduje se, že v roce 2018 bylo celosvětově diagnostikováno více než 18,1 milionu případů pokročilé rakoviny, přičemž každý rok bylo diagnostikováno přibližně 297 000 nádorů centrálního nervového systému (1,6 % všech nádorů)1.Předchozí výzkum ukázal, že rizikové faktory pro rozvoj lidských mozkových nádorů zahrnují různé chemické produkty, rodinnou anamnézu a ionizující záření z terapeutického a diagnostického vybavení hlavy.Přesná příčina těchto malignit však není známa.Přibližně 20 % všech rakovin na celém světě je způsobeno infekčními agens, včetně virů, bakterií a parazitů3,4.Infekční patogeny narušují genetické mechanismy hostitelské buňky, jako je oprava DNA a buněčný cyklus, a mohou vést k chronickému zánětu a poškození imunitního systému5.
Infekční agens související s rakovinou člověka jsou nejběžnějšími virovými patogeny, včetně lidských papilomavirů a virů hepatitidy B a C.Paraziti mohou také hrát potenciální roli ve vývoji rakoviny u lidí.Několik druhů parazitů, jmenovitě Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis a Hymenolepis nana, se podílí na různých typech lidské rakoviny 6,7,8.
Toxoplasma gondii je intracelulární prvok, který reguluje mikroprostředí infikovaných hostitelských buněk.Odhaduje se, že tento parazit infikuje přibližně 30 % světové populace a ohrožuje celou populaci9,10.Toxoplasma gondii může infikovat životně důležité orgány, včetně centrálního nervového systému (CNS), a způsobit závažná onemocnění, jako je smrtelná meningitida a encefalitida, zejména u pacientů s oslabenou imunitou9.Toxoplasma gondii však může také změnit prostředí infikovaného hostitele modulací buněčného růstu a imunitních odpovědí u imunokompetentních jedinců, což vede k udržení asymptomatické chronické infekce9,11.Je zajímavé, že vzhledem ke korelaci mezi prevalencí T. gondii a incidencí mozkového nádoru některé zprávy naznačují, že změny prostředí hostitele in vivo v důsledku chronické infekce T. gondii připomínají mikroprostředí nádoru.
Exozomy jsou známé jako mezibuněčné komunikátory, které dodávají biologický obsah, včetně proteinů a nukleových kyselin, ze sousedních buněk16,17.Exozomy mohou ovlivňovat biologické procesy související s nádorem, jako je antiapoptóza, angiogeneze a metastázy v mikroprostředí nádoru.Zejména miRNA (miRNA), malé nekódující RNA o délce asi 22 nukleotidů, jsou důležitými post-transkripčními genovými regulátory, které kontrolují více než 30 % lidské mRNA prostřednictvím miRNA-indukovaného umlčovacího komplexu (miRISC).Toxoplasma gondii může narušit biologické procesy řízením exprese miRNA v infikovaných hostitelích.Hostitelské miRNA obsahují důležité signály pro regulaci biologických procesů hostitele pro dosažení strategie přežití parazita.Studium změn v profilu miRNA hostitele po infekci T. gondii nám tedy může pomoci lépe pochopit interakci mezi hostitelem a T. gondii.Thirugnanam a kol.15 naznačil, že T. gondii podporuje karcinogenezi mozku změnou své exprese na specifických hostitelských miRNA spojených s růstem nádoru a zjistil, že T. gondii může způsobit gliomy u experimentálních zvířat.
Tato studie se zaměřuje na změnu exosomálního miR-21 v hostitelské mikroglii infikované Toxoplasma BV2.Pozorovali jsme možnou roli změněného exosomálního miR-21 v růstu gliomových buněk U87 v důsledku retence v jádře FoxO1/p27, které je cílem nadměrně exprimovaného miR-21.
Exosomy odvozené z BV2 byly získány pomocí diferenciální centrifugace a validovány různými metodami, aby se zabránilo kontaminaci buněčnými složkami nebo jinými vezikuly.Elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) ukázala odlišné vzory mezi proteiny extrahovanými z buněk BV2 a exosomy (obrázek 1A) a vzorky byly hodnoceny na přítomnost Alix, která byla analyzována Western blotováním markerů exosomálních proteinů v .Značení Alix bylo nalezeno v exosomových proteinech, ale ne v proteinech lyzátu buněk BV2 (obr. 1B).Kromě toho byla purifikovaná RNA z exosomů odvozených z BV2 analyzována pomocí bioanalyzátoru.18S a 28S ribozomální podjednotky byly v migračním vzoru exosomální RNA pozorovány zřídka, což ukazuje na spolehlivou čistotu (obrázek 1C).Konečně, transmisní elektronová mikroskopie ukázala, že pozorované exozomy byly velké asi 60–150 nm a měly pohárovitou strukturu typickou pro morfologii exozomů (obr. 1D).
Charakterizace exosomů odvozených z buněk BV2.(A) Strana bezpečnostního listu.Proteiny byly izolovány z buněk BV2 nebo exozomů odvozených z BV2.Proteinové vzorce se mezi buňkami a exozomy liší.(B) Western blot analýza exosomálního markeru (Alix).(C) Vyhodnocení purifikované RNA z buněk BV2 a exozomů odvozených od BV2 pomocí bioanalyzátoru.Takže ribozomální podjednotky 18S a 28S v buňkách BV2 byly zřídka nalezeny v exosomální RNA.(D) Transmisní elektronová mikroskopie ukázala, že exosomy izolované z buněk BV2 byly negativně obarveny 2% uranylacetátem.Exozomy mají velikost přibližně 60-150 nm a mají tvar misky (Song a Jung, nepublikovaná data).
Buněčná internalizace exozomů odvozených od BV2 do buněk lidského gliomu U87 byla pozorována pomocí konfokální mikroskopie.Exozomy značené PKH26 jsou lokalizovány v cytoplazmě buněk U87.Jádra byla obarvena pomocí DAPI (obr. 2A), což ukazuje, že exosomy odvozené od BV2 mohou být internalizovány hostitelskými buňkami a ovlivňovat prostředí recipientních buněk.
Internalizace exozomů odvozených od BV2 do buněk gliomu U87 a exozomů odvozených od BV2 infikovaných Toxoplasma RH indukovala proliferaci buněk gliomu U87.(A) Exosomy pohlcené buňkami U87 měřené konfokální mikroskopií.Gliomové buňky U87 byly inkubovány s exozomy značenými PKH26 (červeně) nebo bez kontroly po dobu 24 hodin.Jádra byla obarvena DAPI (modrá) a poté pozorována pod konfokálním mikroskopem (měřítko: 10 μm, x 3000).(B) Proliferace gliomových buněk U87 byla stanovena testem buněčné proliferace.Gliomové buňky U87 byly ošetřeny exosomy po uvedenou dobu. *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 podle Studentova t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocí Studentova t-testu.
Po potvrzení internalizace exozomů odvozených od BV2 do gliomových buněk U87 jsme provedli testy buněčné proliferace, abychom prozkoumali roli exozomů odvozených od BV2 odvozených od toxoplasmy ve vývoji lidských gliomových buněk.Ošetření buněk U87 exosomy z buněk BV2 infikovaných T. gondii ukázalo, že exozomy odvozené od BV2 infikované T. gondii způsobily významně vyšší proliferaci buněk U87 ve srovnání s kontrolou (obr. 2B).
Kromě toho měl růst buněk U118 stejné výsledky jako U87, protože exozomy stimulované toxoplasmou způsobily nejvyšší úrovně proliferace (data nejsou uvedena).Na základě těchto údajů můžeme naznačit, že exozomy infikované toxoplasmou odvozené od BV2 hrají důležitou roli v proliferaci gliomových buněk.
Abychom prozkoumali účinek exozomů odvozených od BV2 infikovaných toxoplazmou na vývoj nádoru, injikovali jsme gliomové buňky U87 do nahých myší pro model xenoštěpu a injikovali jsme exozomy odvozené od BV2 nebo exozomy odvozené od RH infikované BV2.Poté, co se nádory objevily po 1 týdnu, byla každá experimentální skupina 5 myší rozdělena podle velikosti nádoru pro stanovení stejného výchozího bodu a velikost nádoru byla měřena po dobu 22 dnů.
U myší s modelem xenograftu U87 byly pozorovány významně větší velikost a hmotnost nádoru ve skupině exozomů infikovaných RH odvozenými od BV2 v den 22 (obr. 3A, B).Na druhé straně nebyl žádný významný rozdíl ve velikosti nádoru mezi skupinou exosomů odvozených od BV2 a kontrolní skupinou po léčbě exosomy.Kromě toho myši, kterým byly injekčně podány gliomové buňky a exozomy, vizuálně vykazovaly největší objem nádoru ve skupině exozomů odvozených od BV2 infikovaných RH (obr. 3C).Tyto výsledky ukazují, že exozomy infikované toxoplasmou odvozené od BV2 indukují růst gliomu v modelu myšího nádoru.
Onkogeneze (AC) exozomů odvozených od BV2 v myším modelu s xenograftem U87.Velikost nádoru (A) a hmotnost (B) byly významně zvýšeny u nahých myší BALB/c léčených exozomy infikovanými RH odvozenými z BV2.Nahým myším BALB/c (C) bylo subkutánně injikováno 1 x 107 buněk U87 suspendovaných ve směsi Matrigel.Šest dní po injekci bylo myším ošetřeno 100 ug exosomů odvozených od BV2.Velikost a hmotnost nádoru byly měřeny v uvedených dnech a po usmrcení. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Data ukázala, že 37 miRNA (16 nadměrně exprimovaných a 21 downexprimovaných) spojených s imunitou nebo vývojem nádoru bylo významně změněno v mikrogliích po infekci kmenem Toxoplasma RH (obr. 4A).Relativní úrovně exprese miR-21 mezi změněnými miRNA byly potvrzeny RT-PCR v reálném čase v exozomech odvozených z BV2, exozomech ošetřených buňkami BV2 a U87.Exprese miR-21 ukázala významný nárůst exosomů z buněk BV2 infikovaných Toxoplasma gondii (kmen RH) (obr. 4B).Relativní úrovně exprese miR-21 v buňkách BV2 a U87 se zvýšily po absorpci změněných exozomů (obr. 4B).Relativní hladiny exprese miR-21 v mozkových tkáních pacientů s nádorem a myší infikovaných Toxoplasma gondii (kmen ME49) byly vyšší než u kontrol (obr. 4C).Tyto výsledky korelují s rozdíly mezi úrovněmi exprese předpokládaných a potvrzených mikroRNA in vitro a in vivo.
Změny v expresi exosomálního miP-21a-5p v mikrogliích infikovaných Toxoplasma gondii (RH).(A) Prokazuje významné změny v siRNA spojené s imunitou nebo vývojem nádoru po infekci T. gondii RH.(B) Relativní úrovně exprese miR-21 byly detekovány pomocí RT-PCR v reálném čase v exozomech odvozených od BV2, exozomech ošetřených BV2 a buňkách U87.(C) Relativní hladiny exprese miR-21 byly nalezeny v mozkových tkáních pacientů s nádorem (N=3) a myší infikovaných Toxoplasma gondii (kmen ME49) (N=3). *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 bylo získáno pomocí Studentova t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocí Studentova t-testu.
Exosomy z buněk BV2 infikovaných RH vedly k růstu gliomů in vivo a in vitro (obr. 2, 3).Pro detekci relevantních mRNA jsme zkoumali hladiny mRNA protinádorových cílových genů, forkhead box 01 (FoxO1), PTEN a programovanou buněčnou smrt 4 (PDCD4) v buňkách U87 infikovaných exozomy odvozenými z BV2 nebo RH BV2.Bioinformatická analýza ukázala, že několik genů spojených s nádory, včetně genů FoxO1, PTEN a PDCD4, má vazebná místa miR-2121,22.Hladiny mRNA protinádorových cílových genů byly sníženy u RH-infikovaných exozomů odvozených od BV2 ve srovnání s exozomy odvozenými od BV2 (obr. 5A).FoxO1 vykazoval snížené hladiny proteinu v RH-infikovaných exozomech odvozených od BV2 ve srovnání s exozomy odvozenými od BV2 (obrázek 5B).Na základě těchto výsledků jsme mohli potvrdit, že exozomy odvozené z RH-infikovaného BV2 downregulují anti-onkogenní geny, přičemž si zachovávají svou roli v růstu nádoru.
Toxoplasma RH-infikované BV2-odvozené exozomy indukují supresi protinádorových genů v U87 gliomových buňkách exozomy BV2 odvozenými od Toxoplasma RH-infikované.(A) PCR v reálném čase exprese FoxO1, PTEN a PDCD4 v exozomech odvozených z BV2 infikovaného T. gondii RH ve srovnání s exozomy PBS.Jako kontrola byla použita p-aktinová mRNA.(B) Exprese FoxO1 byla stanovena Western blotem a denzitometrická data byla statisticky vyhodnocena pomocí programu ImageJ. *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 bylo získáno Studentovým t testem. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 bylo získáno pomocí Studentova t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocí Studentova t-testu.
Abychom pochopili účinek miP-21 v exozomech na regulaci genů souvisejících s nádorem, buňky U87 byly transfekovány inhibitorem miP-21 pomocí Lipofectamine 2000 a buňky byly sklizeny 24 hodin po transfekci.Hladiny exprese FoxO1 a p27 v buňkách transfekovaných inhibitory miR-21 byly porovnány s buňkami ošetřenými exosomy odvozenými od BV2 pomocí qRT-PCR (obr. 6A, B).Transfekce inhibitoru miR-21 do buněk U87 významně snížila expresi Fox01 a p27 (obr. 6).
RH-infikovaný exosomální BV2-odvozený miP-21 změnil expresi FoxO1/p27 v gliomových buňkách U87.Buňky U87 byly transfekovány inhibitorem miP-21 za použití Lipofectamine 2000 a buňky byly sklizeny 24 hodin po transfekci.Hladiny exprese FoxO1 a p27 v buňkách transfekovaných inhibitory miR-21 byly porovnány s hladinami v buňkách ošetřených exozomy odvozenými od BV2 pomocí qRT-PCR (A, B).
Aby unikl imunitní reakci hostitele, parazit Toxoplasma se transformuje na tkáňovou cystu.Parazitují různé tkáně, včetně mozku, srdce a kosterního svalstva, po celou dobu života hostitele a modulují imunitní odpověď hostitele.Kromě toho mohou regulovat buněčný cyklus a apoptózu hostitelských buněk, čímž podporují jejich proliferaci14,24.Toxoplasma gondii infikuje převážně hostitelské dendritické buňky, neutrofily a monocytární/makrofágové linie, včetně mozkových mikroglií.Toxoplasma gondii indukuje diferenciaci makrofágů fenotypu M2, ovlivňuje hojení ran po infekci patogenem a je také spojena s hypervaskularizací a granulomatózní fibrózou.Tato behaviorální patogeneze infekce Toxoplasma může souviset s markery souvisejícími s vývojem nádoru.Nepřátelské prostředí regulované Toxoplasmou může připomínat odpovídající prekancerózu.Dá se tedy předpokládat, že infekce Toxoplasma by měla přispívat ke vzniku mozkových nádorů.Ve skutečnosti byla vysoká míra infekce toxoplasmou hlášena v séru pacientů s různými nádory mozku.Kromě toho může být Toxoplasma gondii dalším karcinogenním efektorem a působí synergicky, aby napomohla dalším infekčním karcinogenům ve vývoji mozkových nádorů.V tomto ohledu stojí za zmínku, že P. falciparum a virus Epstein-Barrové synergicky přispívají ke vzniku Burkittova lymfomu.
Role exosomů jako regulátorů v oblasti výzkumu rakoviny byla rozsáhle zkoumána.Role exosomů mezi parazity a infikovanými hostiteli však zůstává nedostatečně pochopena.Dosud různé regulátory, včetně vylučovaných proteinů, vysvětlily biologické procesy, kterými parazité prvoků odolávají útoku hostitele a udržují infekci.V poslední době se šíří koncept, že mikrovezikuly spojené s prvoky a jejich mikroRNA interagují s hostitelskými buňkami, aby vytvořily příznivé prostředí pro jejich přežití.Proto jsou zapotřebí další studie k odhalení vztahu mezi změněnými exosomálními miRNA a proliferací gliomových buněk.Změna mikroRNA (klastrové geny miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 a miR-17-92) se váže na promotor STAT3 v lidských makrofázích infikovaných toxoplazmou, je regulována a indukuje anti -apoptóza v reakci na infekci Toxoplasma gondii29.Infekce toxoplasmou zvyšuje expresi miR-17-5p a miR-106b-5p, které jsou spojeny s několika hyperproliferativními onemocněními30.Tato data naznačují, že hostitelské miRNA regulované infekcí Toxoplasma jsou důležitými molekulami pro přežití parazitů a patogenezi v biologickém chování hostitele.
Změněné miRNA mohou ovlivnit různé typy chování během iniciace a progrese maligních buněk, včetně gliomů: soběstačnost růstových signálů, necitlivost na signály inhibující růst, únik apoptózy, neomezený replikační potenciál, angiogeneze, invaze a metastázy a zánět.U gliomu byly změněné miRNA identifikovány v několika studiích profilování exprese.
V této studii jsme potvrdili vysoké hladiny exprese miRNA-21 v hostitelských buňkách infikovaných toxoplazmou.miR-21 byla identifikována jako jedna z nejčastěji overexprimovaných mikroRNA v solidních nádorech, včetně gliomů, 33 a její exprese koreluje se stupněm gliomu.Hromadné důkazy naznačují, že miR-21 je nový onkogen, který působí jako antiapoptotický faktor při růstu gliomu a je vysoce nadměrně exprimován ve tkáních a plazmě malignit lidského mozku.Je zajímavé, že inaktivace miR-21 v gliomových buňkách a tkáních spouští inhibici buněčné proliferace v důsledku apoptózy závislé na kaspáze.Bioinformatická analýza miR-21 předpokládaných cílů odhalila mnohočetné tumor supresorové geny spojené s dráhami apoptózy, včetně programované buněčné smrti 4 (PDCD4), tropomyosinu (TPM1), PTEN a forkhead box O1 (FoxO1), s vazebným místem miR-2121..22.38.
FoxO1, jako jeden z transkripčních faktorů (FoxO), se podílí na vývoji různých typů lidských rakovin a může regulovat expresi tumor supresorových genů, jako jsou p21, p27, Bim a FasL40.FoxO1 může vázat a aktivovat inhibitory buněčného cyklu, jako je p27, k potlačení buněčného růstu.Kromě toho je FoxO1 klíčovým efektorem signalizace PI3K/Akt a reguluje mnoho biologických procesů, jako je progrese buněčného cyklu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace transkripce p2742.
Závěrem se domníváme, že exosomální miR-21 odvozený z mikroglií infikovaných toxoplasmou může hrát důležitou roli jako regulátor růstu gliomových buněk (obr. 7).K nalezení přímé souvislosti mezi exosomální miR-21, změněnou infekcí toxoplasmou a růstem gliomu jsou však zapotřebí další studie.Očekává se, že tyto výsledky poskytnou výchozí bod pro studium vztahu mezi toxoplasmovou infekcí a výskytem gliomu.
V této studii je navržen schematický diagram mechanismu karcinogeneze gliomu (mozku).Autor kreslí v PowerPointu 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Všechny experimentální protokoly v této studii, včetně použití zvířat, byly v souladu se standardními etickými pokyny Výboru pro péči o zvířata a uživatele Seoul National University a byly schváleny Institutional Review Board of Soul National University School of Medicine (IRB číslo SNU- 150715).-2).Všechny experimentální postupy byly provedeny v souladu s doporučeními ARRIVE.
BV2 myší mikroglie a lidské gliomové buňky U87 byly kultivovány v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Soul, Korea) a Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), každá obsahující 10 % fetálního hovězího séra, 4 mM l- glutamin, 0,2 mM penicilin a 0,05 mM streptomycin.Buňky byly kultivovány v inkubátoru s 5% CO2 při 37 °C.Další gliomová buněčná linie, U118, byla použita pro srovnání s buňkami U87.
K izolaci exozomů z kmenů RH a ME49 infikovaných T. gondii byly tachyzoity T. gondii (kmen RH) sklizeny z břišní dutiny 6 týdnů starých myší BALB/c, kterým byly injikovány 3-4 dny před.Tachyzoity byly třikrát promyty PBS a purifikovány centrifugací ve 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.K získání tachyzoitů kmene ME49 bylo myším BALB/c intraperitoneálně injikováno 20 tkáňových cyst a transformace tachyzoitů v cystách byla odebrána promytím břišní dutiny 6. až 8. den po infekci (PI).Myši infikované PBS.Tachyzoity ME49 byly pěstovány v buňkách doplněných 100 μg/ml penicilinu (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycinu (Gibco/BRL) a 5 % fetálního hovězího séra (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) při 37 °C a 5 % oxidu uhličitého.Po kultivaci ve Vero buňkách byly ME49 tachyzoity dvakrát protlačeny jehlou 25 gauge a poté 5 um filtrem, aby se odstranily zbytky a buňky.Po promytí byly tachyzoity resuspendovány v PBS44.Tkáňové cysty Toxoplasma gondii kmen ME49 byly udržovány intraperitoneální injekcí cyst izolovaných z mozku infikovaných myší C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Mozky myší infikovaných ME49 byly sklizeny po 3 měsících PI a rozemlety pod mikroskopem, aby se izolovaly cysty.Infikované myši byly drženy ve speciálních podmínkách bez patogenů (SPF) na lékařské fakultě Národní univerzity v Soulu.
Celková RNA byla extrahována z BV2-odvozených exozomů, BV2 buněk a tkání pomocí miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle instrukcí výrobce, včetně inkubační doby pro krok eluce.Koncentrace RNA byla stanovena na spektrofotometru NanoDrop 2000.Kvalita mikročipů RNA byla hodnocena pomocí bioanalyzátoru Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Nizozemí).
DMEM s 10% FBS chudým na exosom byl připraven ultracentrifugací při 100 000 g po dobu 16 hodin při 4 °C a filtrován přes 0,22 um filtr (Nalgene, Rochester, NY, USA).Buňky BV2, 5 x 105, byly kultivovány v DMEM obsahujícím 10 % FBS zbaveného exosomů a 1 % antibiotik při 37 °C a 5 % CO2.Po 24 hodinách inkubace byly k buňkám přidány tachyzoity kmene RH nebo ME49 (MOI = 10) a neinvazivní paraziti byli během hodiny odstraněni a znovu naplněni DMEM.Exosomy z buněk BV2 byly izolovány modifikovanou diferenciální centrifugací, nejpoužívanější metodou.Resuspendujte pelet exosomu ve 300 µl PBS pro analýzu RNA nebo proteinu.Koncentrace izolovaných exozomů byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) a spektrofotometru NanoDrop 2000.
Precipitáty z buněk BV2 nebo exozomy odvozené z BV2 byly lyžovány v proteinovém extrakčním roztoku PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) a proteiny byly naneseny na 10% SDS polyakrylamidové gely obarvené Coomassie brilantní modří.Kromě toho byly proteiny přeneseny na PVDF membrány na 2 hodiny.Western bloty byly validovány s použitím protilátky Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) jako exosomálního markeru.HRP-konjugovaný kozí anti-myší IgG (H+L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) a LAS-1000 plus luminiscenční obrazový analyzátor (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japonsko) byly použity jako sekundární protilátka..Pro studium velikosti a morfologie exozomů byla provedena transmisní elektronová mikroskopie.Exosomy izolované z buněk BV2 (6,40 ug/ul) byly připraveny na uhlíkem potažených sítích a negativně barveny 2% uranylacetátem po dobu 1 minuty.Připravené vzorky byly pozorovány při urychlovacím napětí 80 kV pomocí JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonsko) vybavené CCD kamerou ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Exozomy odvozené od BV2 byly barveny pomocí sady PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) po dobu 15 minut při teplotě místnosti.Buňky U87, 2x105, s PKH26-značenými exozomy (červeně) nebo bez exozomů jako negativní kontrola, byly inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin v 5% CO2 inkubátoru.Buněčná jádra U87 byla obarvena DAPI (modrá), buňky U87 byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 15 minut při 4 °C a poté analyzovány v systému konfokálního mikroskopu Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Německo).pozorovatelný.
cDNA byla syntetizována ze siRNA pomocí syntézy prvního vlákna Mir-X siRNA a soupravy SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko).Kvantitativní PCR v reálném čase byla provedena pomocí detekčního systému iQ5 real time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) s použitím primerů a templátů smíchaných s SYBR Premix.DNA byla amplifikována pro 40 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 15 s a nasedání při 60 °C po dobu 60 s.Data z každé PCR reakce byla analyzována pomocí modulu pro analýzu dat softwaru optického systému iQ™5 (Bio-Rad).Relativní změny v genové expresi mezi vybranými cílovými geny a β-aktin/siRNA (a U6) byly vypočteny pomocí metody standardní křivky.Použité sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1.
3 x 104 gliomových buněk U87 bylo nasazeno na 96jamkové destičky a smícháno s exozomy infikovanými toxoplasmou odvozenými z BV2 (50 μg/ml) nebo nepulzními exozomy odvozenými z BV2 (50 μg/ml) jako kontrolami po 12, 18 a 36 hodinách .Rychlost buněčné proliferace byla stanovena pomocí Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) (doplňkové obrázky S1-S3)46.
Samice nahých myší BALB/c staré 5 týdnů byly zakoupeny od Orient Bio (Seongnam-si, Jižní Korea) a chovány jednotlivě ve sterilních klecích při teplotě místnosti (22 ± 2 °C) a vlhkosti (45 ± 15 °C).%) při pokojové teplotě (22±2 °C) a vlhkosti (45±15 %).12hodinový světelný cyklus a 12hodinový cyklus tmy byly provedeny pod SPF (Soul National University School of Medicine Animal Center).Myši byly náhodně rozděleny do tří skupin po 5 myších a všem skupinám bylo subkutánně injikováno 400 ml PBS obsahujícího 1 x 107 gliomových buněk U87 a BD Matrigel™ se sníženým růstovým faktorem (BD Science, Miami, FL, USA).Šest dní po injekci nádoru bylo do místa nádoru injikováno 200 mg exosomů odvozených z buněk BV2 (s/bez infekce Toxoplasma).Dvacet dva dní po infekci nádoru byla velikost nádoru u myší v každé skupině měřena posuvným měřítkem třikrát týdně a objem nádoru byl vypočten podle vzorce: 0,5 x (šířka) x 2 x délka.
Analýza exprese mikroRNA pomocí miRCURYTM LNA miRNA pole, 7. generace has, mmu a rno pole (EXIQON, Vedbaek, Dánsko) zahrnující 1119 dobře charakterizovaných myší mezi 3100 lidskými, myšími a potkaními sondami pro zachycení miRNA.Během tohoto postupu bylo z 5'-fosfátu odstraněno 250 až 1000 ng celkové RNA ošetřením telecí střevní alkalickou fosfatázou s následným značením zeleným fluorescenčním barvivem Hy3.Značené vzorky byly poté hybridizovány nanesením mikročipových sklíček za použití hybridizační komůrkové sady (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a hybridizační sady sklíček (Agilent Technologies).Hybridizace byla prováděna po dobu 16 hodin při 56 °C, poté byly mikročipy promyty v souladu s doporučeními výrobce.Zpracovaná mikročipová sklíčka byla poté skenována pomocí mikročipového skenerového systému Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Naskenované obrázky byly importovány pomocí softwaru Agilent Feature Extraction verze 10.7.3.1 (Agilent Technologies) a intenzita fluorescence každého obrázku byla kvantifikována pomocí odpovídajícího souboru GAL upraveného protokolu Exiqon.Microarray data pro současnou studii jsou uložena v databázi GEO pod přístupovým číslem GPL32397.
Profily exprese zralých exosomálních miRNA v mikrogliích kmenů RH nebo ME49 infikovaných Toxoplasma byly analyzovány pomocí různých síťových nástrojů.miRNA spojené s vývojem nádoru byly identifikovány pomocí miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) a odfiltrovány s normalizovanou intenzitou signálu (log2) vyšší než 8,0.Mezi miRNA bylo zjištěno, že rozdílně exprimované miRNA jsou více než 1,5krát změněny filtrační analýzou miRNA pozměněných kmeny RH nebo ME49 infikovanými T. gondii.
Buňky byly nasazeny na šestijamkové destičky (3 x 105 buněk/jamka) v opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfekované buňky byly kultivovány po dobu 6 hodin a poté bylo médium vyměněno za čerstvé kompletní médium.Buňky byly sklizeny 24 hodin po transfekci.
Statistická analýza byla provedena především pomocí Studentova t-testu se softwarem Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Pro experimentální analýzu zvířat byla provedena dvoucestná ANOVA pomocí softwaru Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-hodnoty < 0,05 byly považovány za statisticky významné. P-hodnoty < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Hodnoty P <0,05 byly považovány za statisticky významné. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值 < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Hodnoty P <0,05 byly považovány za statisticky významné.
Všechny experimentální protokoly použité v této studii byly schváleny Institutional Review Board of Soul National University School of Medicine (IRB číslo SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. a kol.Odhadovaná celosvětová incidence a mortalita rakoviny v roce 2018: zdroje a metody GLOBOCAN.Výklad.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pohled na rizikové faktory mozkových nádorů a jejich terapeutické intervence. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pohled na rizikové faktory mozkových nádorů a jejich terapeutické intervence.Rashid, S., Rehman, K. a Akash, MS Přehled rizikových faktorů mozkových nádorů a hlavních terapeutických intervencí. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Hluboké pochopení rizikových faktorů mozkových nádorů a terapeutických intervencí.Rashid, S., Rehman, K. a Akash, MS Přehled rizikových faktorů mozkových nádorů a hlavních terapeutických intervencí.Biomedicína.Farmaceut.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriálně-virové interakce u rakoviny lidského orodigestivního a ženského genitálního traktu: Souhrn epidemiologických a laboratorních důkazů. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriálně-virové interakce u rakoviny lidského orodigestivního a ženského genitálního traktu: Souhrn epidemiologických a laboratorních důkazů.Kato I., Zhang J. a Sun J. Bakteriálně-virové interakce u rakoviny lidského gastrointestinálního traktu a ženského genitálního traktu: souhrn epidemiologických a laboratorních údajů. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virové interakce v trávení lidské ústní dutiny a ženského reprodukčního traktu: shrnutí populární vědy o chorobách a laboratorních důkazů.Kato I., Zhang J. a Sun J. Bakteriálně-virové interakce u lidské gastrointestinální rakoviny a rakoviny ženských genitálií: souhrn epidemiologických a laboratorních údajů.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Od infekce k rakovině: Jak DNA nádorové viry mění centrální metabolismus uhlíku a lipidů hostitelské buňky. Magon, KL & Parish, JL Od infekce k rakovině: Jak DNA nádorové viry mění centrální metabolismus uhlíku a lipidů hostitelské buňky.Mahon, KL a Parish, JL Oheň infekce na rakovinu: jak nádorové viry založené na DNA mění centrální metabolismus uhlíku a lipidů hostitelské buňky. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代何毒如何改变宿 Magon, KL & Parish, JL Od infekce k rakovině: jak DNA nádorové viry mění centrální metabolismus uhlíku a lipidů hostitelské buňky.Mahon, KL a Parish, JL Přenáší infekci na rakovinu: jak DNA nádorové viry mění centrální metabolismus uhlíku a lipidů v hostitelských buňkách.Otevřená biologie.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM a kol.Katecholové estrogeny schistosom a jaterních motolic a rakovina spojená s helminty.přední.uvnitř horko.5, 444 (2014).